Name: 一个NMDA受体电导的大鼠中脑多巴胺能神经元的动态钳技术中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学习动态钳技术在大鼠中脑多巴胺能神经元中的应用，通过精确控制NMDA受体电导来诱发动作电位爆发。该方法为神经电生理学研究提供了实时操控神经元活动的有效工具。

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本工作由 MH084494（CJL）以及 MH079276 和 NS060658（CAP）资助。

1. 切片制备
<ol>
	<li>使用振动切片机切割脑组织切片。我们采用振动切片机（Microm HM 650V），按照德克萨斯大学圣安东尼奥分校机构动物护理与使用委员会的规定，从异氟烷麻醉的Sprague-Dawley大鼠（Charles River Laboratories）制备240 μm厚的水平中脑切片。</li>
	<li>将切片保存在孵育 chamber 中，直至准备记录。我们使用加热至32°C的孵育容器，其中充满人工脑脊液（aCSF；单位为 mM）：126 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、4 MgCl2、2 CaCl2、10 dextrose、25 NaHCO3、1.3 ascorbic acid、2.4 sodium pyruvate 和 0.05 glutathione。</li>
</ol>
2. 电生理记录
<ol>
	<li>将脑片转移至细胞内记录装置中，该装置内灌流温度为35°C的人工脑脊液（aCSF）。所用aCSF成分与1.2步骤相同，但使用2 mM MgCl2且不添加谷胱甘肽。对于水平切制的脑片，通常沿中线将其一分为二。</li>
	<li>观察目标神经元。我们使用梯度对比成像系统观察黑质中的单个多巴胺能神经元。</li>
	<li>使用电子电极拉制仪制备电极。我们采用P97型微电极拉制仪（Sutter Instrument Company）拉制电极，使其尖端电阻为4–10 MΩ。</li>
	<li>用所需的细胞内液填充电极。我们使用的细胞内液成分（单位：mM）如下：138 K-葡萄糖酸盐、10 HEPES、2 MgCl2、0.2 EGTA、0.0001 CaCl2、4 Na-ATP、0.4 Na-GTP。使用1 M KOH将细胞内液pH值调节至7.3，渗透压调节至270–275 mOsms。</li>
	<li>在目标神经元上形成吉欧姆（gigaohm）级封接，随后通过负压破膜，建立全细胞记录模式。我们采用Multiclamp 700B放大器，将放大器设置为“I=0”电流钳模式。</li>
</ol>
3. 使用动态钳技术进行电导应用
<ol>
	<li>在动态钳制计算机上运行 RTXI（www.rtxi.org）。将一个包含 NMDA 受体的自定义模型加载到内存中。通过以下方程实时计算注入细胞的电流： 
INMDA = -gNMDA * [1/(1+([Mg]/3.57) * e(-Vm*0.062))] * (Vm - ENMDA)
其中，gNMDA 为期望的电导（单位为 nS；默认设置为 0 nS），[Mg] 为镁离子浓度（在下文示例中设为 1.5 mM），ENMDA 为 NMDA 受体的反转电位（设为 0 mV），Vm 为从放大器测得的细胞膜电位（单位为毫伏）。</li>
	<li>将动态钳制计算机的输出通过模数转换器连接至放大器的命令输入端。</li>
	<li>将放大器设置为“IC”电流钳制模式。</li>
	<li>在 RTXI 中输入所需的 NMDA 受体电导值（例如 40 nS）。此时应可观察到一连串时相性的动作电位爆发。或者，也可通过模拟输出向 RTXI 提供电导信号（图 1A，“g(t)”）。必须在 RTXI 中使用适当的缩放系数，将电压信号转换为西门子单位。</li>
</ol>
4. 代表性结果
图1A展示了使用动态钳技术施加电导的成功实验设置。利用该设置，我们对黑质致密部中的多巴胺能神经元进行了全细胞胞体记录。多巴胺能神经元通常以较低频率自发放电，呈现类似起搏器的放电模式。通过动态钳技术阶段性施加NMDA受体电导，可诱发动作电位的簇状放电（图1B）。
<img src="/files/ftp_upload/2275/2275fig1.jpg" alt="显示A/D转换器和MC700B设置的神经元记录示意图；NMDA反应图，10 mV/s。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1： 使用动态钳技术施加NMDA受体电导。A. 硬件设置示意图，显示细胞内记录装置与动态钳计算机之间的连接。B. 在黑质致密部多巴胺能神经元的全细胞记录中，施加40 nS的NMDA受体电导可诱发一连串动作电位。

<ol><li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> J Neurosci Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends Neurosci. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> J Neurophysiol. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends Neurosci. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Deister, C. A., Teagarden, M. A., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neuronal+oscillator+underlies+dopaminergic+neuron+bursting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neuronal oscillator underlies dopaminergic neuron bursting.</a> J Neurosci. 29, 15888-15897 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Wilson, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+role+for+GABA+receptors+on+the+firing+pattern+of+midbrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A dynamic role for GABA receptors on the firing pattern of midbrain dopaminergic neurons.</a> J Neurophysiol. 104, 403-413 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所展示的动态钳技术通过允许实验者模拟受体激活的电生理效应，改进了传统的直接电流注入方法。在本视频中，我们展示了可将NMDA受体激活的效应添加至多巴胺能神经元的自发性活动，即诱发一连串动作电位的爆发。
由于硬件/软件实现具有灵活性，因此可以采用多种扩展方式。注入电流的符号可由负切换为正，代表去除激活受体对神经元影响的情景。模型神经元以一系列微分方程的形式表示，也可通过数值方法求解，使实验者能够研究小型神经网络。

<table><tbody><tr><td>无水葡萄糖酸钾</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; X 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙二醇双(β-氨基&amp;#8211;四氢呋喃-N,N,N&amp;rsquo;，N&amp;rsquo;四乙酸</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>试剂</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>试剂</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，无水</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>试剂</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CholCl</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>试剂</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯 BX51WI 显微镜（配备 40 倍物镜）</td><td>显微镜</td><td>奥林巴斯株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 个模数转换器</td><td>仪器设备</td><td>任何供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B 配 CV-7B 头级放大器</td><td>仪器设备</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>仪器设备</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfil 注射器针头</td><td>仪器设备</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>仪器设备</td><td>Siskiyou, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>监测</td><td>仪器设备</td><td>三视图</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用动态钳技术在大鼠中脑多巴胺能神经元中施加nmda受体电导

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

神经科学家通过研究大脑中神经元之间的通信方式来探索大脑功能。许多研究者会观察一个或多个神经元在实验可控输入条件下的电活动变化。神经元的电活动可以在离体脑片上使用玻璃微电极的膜片钳技术进行记录。传统上，实验人员可以通过微电极直接注入电流、电刺激脑片中的其他细胞或残留的轴突连接，或者通过作用于记录细胞膜上受体的药理学手段来模拟神经元输入。
直流电刺激的优点是在记录位点（通常为胞体）能够以高时间精度传递预设的电流波形。然而，由于没有离子通道被实际打开，它不会改变神经元膜的电阻。电流刺激通常采用矩形脉冲，因此无法模拟离子通道的动力学特性。最后，电流刺激也无法模拟离子通道开放时细胞内发生的化学变化。
受体可通过电刺激或药物刺激进行物理激活。使用脑片电刺激时，实验者对受体激活的时间精度较高。然而，受体激活的空间精度有限，且刺激过程中被激活的具体成分尚不明确。后一问题可通过特异性药理学试剂部分缓解。但遗憾的是，药理学试剂的激活过程通常较慢，且其对记录细胞输入信号的空间精度也不明确。
动态钳技术允许实验者根据细胞膜电位的实时反馈，直接改变注入细胞的电流（Robinson 和 Kawai 1993，Sharp et al., 1993a,b；综述见 Prinz et al. 2004）。该技术使实验者能够模拟记录位点在受体激活后所发生的电学变化。施加电流的实时变化由硬件中实现的数学方程决定。
我们最近使用动态钳技术研究了通过激活黑质致密部多巴胺能神经元中的NMDA受体而产生动作电位簇的现象（Deister 等., 2009；Lobb 等., 2010）。在本视频中，我们演示了将NMDA受体电导引入多巴胺能神经元所需的操作步骤。

在本视频中，我们演示如何在大鼠脑切片中以全细胞记录模式对多巴胺能神经元施加电导。该技术称为动态钳技术。

利用动态钳技术在大鼠中脑多巴胺能神经元中施加NMDA受体电导

神经科学家通过研究大脑中神经元之间的通信方式来探究大脑功能。许多研究者关注……

神经科学家通过研究大脑中神经元之间的通信方式来探索大脑功能。在此过程中，使用动态钳技术施加实验可控的电导，从而诱发单个神经元电活动的变化。首先将脑组织切成薄片，并将其置于充满人工脑脊液的孵育室中保存。随后将脑片转移至膜片钳记录装置。选取一个神经元，并使用连接至记录放大器的动态钳计算机，用记录电极对其进行膜片钳记录。向细胞内施加NMDA受体电导。记录结果显示出发动作电位的簇状放电，表明NMDA受体的激活是多巴胺能神经元产生簇状放电的细胞机制之一。与直接电流注入或药物处理等现有方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够精确定义实验条件下特定受体的激活对活体神经元电活动的影响。在快速取出麻醉后的Bragg dolly大鼠脑组织后，使用振动切片机切割出240微米厚的水平脑片。切片完成后，使用转移移液管将切片放入盛有32摄氏度人工脑脊液的孵育箱中，直至开始记录实验。细胞内记录装置包括一台配备微分干涉相差成像物镜的显微镜、一个显示器、一个灌流系统、MultiClamp 700B放大器、模数转换器、显微操作器和前置放大器头级。一台Mac Pro计算机运行数据采集软件AxoGraph X和MultiClamp Commander软件，紧邻细胞内记录装置和Mac Pro计算机的是一台Sun Microsystems计算机，运行实时Linux系统，并配备其专用的模数转换器，用于动态钳制技术。细胞内记录装置应以约 35°C 的人工脑脊液进行灌流。若待记录的脑片为水平切片，使用移液器将其转移至含人工脑脊液的培养皿中，并用切割工具沿中线将脑片一分为二。接下来，为进行电生理记录，使用移液器将脑片转移至细胞内记录装置中。使用40倍物镜观察此处的目标神经元，可见一个独立的黑质多巴胺能神经元。注意其椭圆形的胞体及两条延伸的树突。使用电子P 97微量移液器拉制电极，使其尖端电阻为4至10兆欧姆。接下来，使用微填充注射器针头，将电极内液注入电极中。通过连接在半电池上的注射器（该半电池通过一小段管路与放大器的前置放大器相连），将充满溶液的电极插入半电池中。对记录电极施加少量正压。在视觉引导下，将电极移至目标神经元上。细胞表面会出现一个凹陷。施加少量负压，以在目标神经元上形成吉欧封接（giga seal）。通过嘴部吸力使封接破裂，形成全细胞记录。封接破裂后，使用 Multi Clamp Commander 软件界面将放大器置于电流钳模式，此时不注入任何电流。为了向该细胞施加NMDA电导，首先在动态钳制计算机上运行RTXI软件，然后将包含NMDA受体的自定义模型加载到内存中。一旦模型加载至RTXI内存，我将使用此处所示公式实时计算需注入细胞的电流，其中G-N-M-D-A为设定为零纳西门子的所需电导（单位：纳西门子）。默认情况下，Siemens 中的 MG 表示镁离子浓度。E-N-M-D-A 是 NMDA 受体的反转电位，设定为 0 毫伏，而 VM 是从放大器测得的细胞膜电位，单位为毫伏。现在，使用标准的 BNC 电缆，将动态钳制计算机的输出端连接到带有模数转换器的放大器的指令输入端。使用多钳制指挥软件界面将放大器置于标准的电流钳模式（ic）。RTXI 已设置为通过 Axo Graph X 数据采集软件的电压信号接收所需的电导 GFT。在此执行一个简单的 AXO Graph X 协议，向细胞施加持续一秒、大小为 40 纳西门子的电导阶跃。使用本视频中描述的实验装置，通过动态钳技术对来自黑质致密部多巴胺能神经元的全细胞胞体记录进行检测，发现施加电导阶跃可诱发一连串动作电位。多巴胺能神经元通常以类似起搏器的模式自发低频放电。通过动态钳技术阶段性施加NMDA受体电导，可诱发动作电位的爆发式发放。观看本视频后，您应能充分理解如何在分离的脑片中将 NMDA 电导施加到活体多巴胺能神经元上。然而，该技术也可用于任何能够通过标准膜片钳电生理技术进行记录的细胞类型。类似地，动态钳技术还可进一步扩展，以模拟多种受体类型的电学效应。我们希望本视频有助于展示动态钳制技术的原理以及我们在实验室中如何应用该技术。感谢您的观看。

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