利用动态钳技术在大鼠中脑多巴胺能神经元中施加NMDA受体电导

神经科学家通过研究大脑中神经元之间的通信方式来探索大脑功能。在此过程中，使用动态钳技术施加实验可控的电导，从而诱发单个神经元电活动的变化。首先将脑组织切成薄片，并将其置于充满人工脑脊液的孵育室中保存。

随后将脑片转移至膜片钳记录装置。选取一个神经元，并使用连接至记录放大器的动态钳计算机，用记录电极对其进行膜片钳记录。向细胞内施加NMDA受体电导。

记录结果显示出发动作电位的簇状放电，表明NMDA受体的激活是多巴胺能神经元产生簇状放电的细胞机制之一。与直接电流注入或药物处理等现有方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够精确定义实验条件下特定受体的激活对活体神经元电活动的影响。在快速取出麻醉后的Bragg dolly大鼠脑组织后，使用振动切片机切割出240微米厚的水平脑片。

切片完成后，使用转移移液管将切片放入盛有32摄氏度人工脑脊液的孵育箱中，直至开始记录实验。细胞内记录装置包括一台配备微分干涉相差成像物镜的显微镜、一个显示器、一个灌流系统、MultiClamp 700B放大器、模数转换器、显微操作器和前置放大器头级。一台Mac Pro计算机运行数据采集软件AxoGraph X和MultiClamp Commander软件，紧邻细胞内记录装置和Mac Pro计算机的是一台Sun Microsystems计算机，运行实时Linux系统，并配备其专用的模数转换器，用于动态钳制技术。

细胞内记录装置应以约 35°C 的人工脑脊液进行灌流。若待记录的脑片为水平切片，使用移液器将其转移至含人工脑脊液的培养皿中，并用切割工具沿中线将脑片一分为二。接下来，为进行电生理记录，使用移液器将脑片转移至细胞内记录装置中。

使用40倍物镜观察此处的目标神经元，可见一个独立的黑质多巴胺能神经元。注意其椭圆形的胞体及两条延伸的树突。使用电子P 97微量移液器拉制电极，使其尖端电阻为4至10兆欧姆。

接下来，使用微填充注射器针头，将电极内液注入电极中。通过连接在半电池上的注射器（该半电池通过一小段管路与放大器的前置放大器相连），将充满溶液的电极插入半电池中。对记录电极施加少量正压。

在视觉引导下，将电极移至目标神经元上。细胞表面会出现一个凹陷。施加少量负压，以在目标神经元上形成吉欧封接（giga seal）。

通过嘴部吸力使封接破裂，形成全细胞记录。封接破裂后，使用 Multi Clamp Commander 软件界面将放大器置于电流钳模式，此时不注入任何电流。

为了向该细胞施加NMDA电导，首先在动态钳制计算机上运行RTXI软件，然后将包含NMDA受体的自定义模型加载到内存中。一旦模型加载至RTXI内存，我将使用此处所示公式实时计算需注入细胞的电流，其中G-N-M-D-A为设定为零纳西门子的所需电导（单位：纳西门子）。

默认情况下，Siemens 中的 MG 表示镁离子浓度。E-N-M-D-A 是 NMDA 受体的反转电位，设定为 0 毫伏，而 VM 是从放大器测得的细胞膜电位，单位为毫伏。现在，使用标准的 BNC 电缆，将动态钳制计算机的输出端连接到带有模数转换器的放大器的指令输入端。

使用多钳制指挥软件界面将放大器置于标准的电流钳模式（ic）。RTXI 已设置为通过 Axo Graph X 数据采集软件的电压信号接收所需的电导 GFT。在此执行一个简单的 AXO Graph X 协议，向细胞施加持续一秒、大小为 40 纳西门子的电导阶跃。

使用本视频中描述的实验装置，通过动态钳技术对来自黑质致密部多巴胺能神经元的全细胞胞体记录进行检测，发现施加电导阶跃可诱发一连串动作电位。多巴胺能神经元通常以类似起搏器的模式自发低频放电。通过动态钳技术阶段性施加NMDA受体电导，可诱发动作电位的爆发式发放。

观看本视频后，您应能充分理解如何在分离的脑片中将 NMDA 电导施加到活体多巴胺能神经元上。然而，该技术也可用于任何能够通过标准膜片钳电生理技术进行记录的细胞类型。类似地，动态钳技术还可进一步扩展，以模拟多种受体类型的电学效应。

我们希望本视频有助于展示动态钳制技术的原理以及我们在实验室中如何应用该技术。感谢您的观看。