一种等位基因特异性基因表达检测法，用于验证遗传关联的功能基础

以下实验的总体目标是检测某种特定的DNA变异（例如与疾病相关的变异）是否会影响特定基因的表达水平。该目标通过选择对该变异位点以及目的基因中的编码区SNP均为杂合的细胞系来实现。第二步，从细胞中提取DNA和RNA，并将其作为模板进行等位基因特异性的单碱基延伸反应。

随后通过质谱分析主要的延伸产物，以定量两种等位基因的相对丰度。获得的结果可显示与疾病相关的原始DNA变异是否也与基于质谱定量等位基因特异性测量的基因表达差异相关。该技术的主要优势在于，与荧光素酶报告基因检测不同，它无需进行分子操作，并且能够检测内源性基因表达水平。

此外，我们能够以内部对照的方式比较两个等位基因之间的表达水平，从而消除部分实验变异性。该方法有助于回答人类遗传学领域中的关键问题，例如遗传关联背后的分子机制。当我们在识别跨越三个基因的遗传关联时首次提出该方法的设想，但无法将信号精确定位到单个基因上。

通过进一步的遗传定位。用于本实验的细胞应表达目标基因，并满足两个基本的基因型要求：必须对与疾病相关的DNA序列以及能够根据染色体来源区分转录本的DNA标记均为杂合状态。在本研究展示的细胞系筛选策略中，细胞系A和B对转录的编码标记（以三角形表示）均为杂合。

然而，Omnicell A 系对于与疾病相关的 DNA 序列（即由圆形表示的风险 DNA 变异体）呈杂合状态。该风险变异体的蓝色等位基因与较低水平的转录相关。在根据供应商的说明选择细胞系培养物后，我们将在此演示中使用成纤维细胞。尽管该检测同样适用于其他类型的细胞（包括原代细胞），但仍需分别准备两个 10 厘米的培养皿，用于 DNA 和 RNA 的提取。

当细胞达到80%融合度时，可采用标准方法（包括适用于所选细胞类型的商业化试剂盒）收获细胞，用于DNA和RNA提取。在进行本实验前，为每个DNA标记设计两对PCR引物：一对用于基因组DNA扩增，另一对用于cDNA扩增；设计cDNA扩增的正向和反向引物时应位于不同的外显子上，以避免基因组污染；引物设计应使每个细胞系的PCR产物长度在100至500个碱基对之间；每次准备八微升的PCR反应体系，其中四次独立反应用于基因组DNA扩增，另四次独立反应用于cDNA扩增。

与PCR反应相关的微量组分包含MLA的tack dn、NTPs引物、氯化镁，以及基因组DNA或CD NA。在针对每对引物优化的条件下运行PCR反应，并保持循环次数处于扩增的线性阶段。PCR反应完成后，通过向每个PCR产物中加入核酸外切酶一和虾碱性磷酸酶SAP，并在37摄氏度孵育20分钟，随后在85摄氏度孵育15分钟，以去除PCR引物和过量的DN TPS。

将每种PCR产物在384孔板上重复点样两次，以便每种样本获得八个测量值。初筛延伸实验共需16个点样位点。使用检测设计软件设计延伸引物，使其可同时用于基因组DNA和cDNA-PCR产物。

指定引物长度为14至18个碱基对。使用三种脱氧核苷酸终止子和一种脱氧核苷酸的适当混合物进行第一轮延伸反应。典型的第一轮延伸反应包括：94°C预变性2分钟，随后进行40个循环，每个循环为94°C 5秒、52°C 5秒和72°C 5秒。

最后，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法，使用光谱读取质谱仪对延伸后的寡核苷酸进行定量。本实验方案的一个关键点是采用多种策略控制实验噪声，以排除假象。实验至少重复三次至关重要。

该实验的最佳对照是使用对包被SNIP检测具有杂合性的细胞系进行初延伸，但该细胞系不携带与疾病相关的等位基因。此外，应设计针对替代DNA转录编码标记的检测方法。如果这些条件不可行，则可通过针对初延伸检测中不同外显子的其他PCR引物对来提供额外的对照。

可通过设计延伸引物并使其与正向和反向链均发生退火来提供内参对照。此处展示了一个等位基因特异性表达分析的示例，并附有质谱图谱的实例。该图显示了在四种不同模板上进行的四种等位游戏副本特异性初级延伸产物分析的结果。

上方两个图表表示对两个不同细胞系的基因组DNA分析所获得的结果，这两个细胞系在转录的编码多态性位点上均为杂合子。然而，只有细胞系A在风险DNA变异位点上为杂合子。下方两个图表表示对相同细胞系所产生的cDNA进行分析所获得的结果，该结果源于实验过程中的技术假象。

第一个峰始终高于第二个峰，即使在基因组分析中也是如此。因此，利用基因组分析的结果对cDNA数据进行标准化。通过从Mass Array分型软件中提取所有ELO分型报告来进行统计分析。

本报告提供了关于峰面积的数据，此处展示了一个涉及两种细胞系的示例：细胞A和细胞B在编码区单核苷酸位点上均为杂合状态，但仅细胞A在与疾病相关的标记位点上呈杂合状态。灰色背景的列表示由软件直接生成，绿色背景的列表示针对每种细胞手动计算得出。cDNA和基因组DNA均各有八次测量结果。

该软件将计算每个光谱峰下方的面积，该面积代表两个等位基因各自的丰度。通过将每个 cDNA 和基因组样本中等位基因一的面积除以等位基因二的面积，计算等位基因比例。在八次测量结果的基础上计算平均值和标准误。

较高的标准误（大于0.1）表明测量结果不一致，应予以舍弃。最后，通过基因组DNA的平均比值对cDNA的平均比值进行标准化，以评估其偏离比值1的程度；当等位基因特异性表达无差异时，预期比值为1。在细胞A中，标准化后的比值与1存在差异，而在细胞B中则接近1，该数据表明细胞系A在相位上携带一个DNA变异，该变异与第二个峰所检测的等位基因相关联，从而降低了被分析基因的表达水平。

细胞系B提供了一个非常方便的阴性对照。在尝试本实验流程时，明确定义具有信息性的遗传变异以及设定适当的实验对照至关重要。通过该流程，还可采用其他方法，如单倍型分析或特异性染色质免疫沉淀，以回答诸如在缺乏可用来分析等位基因特异性基因表达的转录标记时，遗传变异位于何处等问题。

观看本视频后，您应能充分理解如何以等位基因特异性方式分析 RNA，以及如何利用该方法研究具有遗传学意义的功能性变异。