Name: 等位基因特异性基因表达检测，测试的遗传协会的功能基础 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 了解等位基因特异性基因表达检测方法，利用MALDI-TOF质谱技术定量分析杂合细胞中的等位基因表达水平。该技术无需分子操作即可直接测量内源性基因表达，为遗传关联的功能机制研究提供可靠手段。

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本工作由惠康信托基金（Wellcome Trust）资助，资助编号分别为 A.P.M. [076566/Z/05/Z]、J.C.K. [074318]，以及惠康信托人类遗传学中心的核心资助 [075491/Z/04]。

1）细胞培养
<ol>
<li>选择表达目的基因的细胞类型。</li>
<li>选择在目的基因内对DNA风险变异位点和转录编码多态性均为杂合状态的细胞系（图1）。</li>
<li>根据供应商的说明培养所选细胞系，并准备2个10 cm的培养皿，分别用于DNA和RNA的提取。</li>
<li>当细胞达到80%融合度时，开始进行细胞收获，并按照下述实验步骤或使用市售试剂盒提取DNA和RNA。</li>
</ol>
2) DNA 提取
<ol>
<li>移除培养皿中的培养基，用 PBS 洗涤，并向培养皿中加入 500 μL 裂解液（0.6% SDS，100 mM NaCl，50 mM Tris，20 mM EDTA）的 50 μg/mL RNase A</li>
<li>在室温下轻轻摇动培养板20分钟。</li>
<li>将细胞裂解物刮入微量离心管中，于指定条件下孵育 37 °C 过夜。</li>
<li>加入蛋白酶K至终浓度为 100 μg/mL 并在指定条件下孵育 37 °C 过夜。</li>
<li>用等体积的酚-氯仿（pH 8）抽提DNA，重复一次，再用等体积的氯仿/异戊醇抽提。</li>
<li>用1/10体积的沉淀剂沉淀DNAth 3 体积的 3 M NaCl 和 2.5 体积的 100% 乙醇</li>
<li>冰上静置5分钟，然后在4℃下以13,000 rpm离心30分钟 4 °C.</li>
<li>用70%乙醇洗涤DNA，室温晾干，然后重悬于 200 μL TE的</li>
<li>孵育于 65 °C 10分钟，然后在室温下放置2天。</li>
<li>储存于 4 °C 或长期保存于 -20 °C.</li>
</ol>
3) RNA 提取
<ol>
<li>移除培养皿中的培养基，用 PBS 洗涤，加入 1 mL TRIzol，在室温下孵育 10 分钟。</li>
<li>刮取细胞，反复吹打几次，转移至微量离心管中并孵育 5 分钟。</li>
<li>在 4°C 下以 10,000 rpm 离心 10 分钟。</li>
<li>将上清液转移至新的离心管中，加入 200 μL 氯仿。</li>
<li>充分振荡后，在 4°C 下以 10,000 rpm 离心 10 分钟。</li>
<li>将水相转移至新的离心管中，加入等体积的 70% 乙醇。</li>
<li>将溶液上样至 1 或 2 个 RNeasy 柱（根据体积决定），在最大转速下离心 30 秒。</li>
<li>此后按照 RNeasy 试剂盒（Qiagen）的说明书操作。</li>
</ol>
4) 核酸样品制备
<ol>
<li>使用 NanoDrop 分光光度计（Thermo Scientific）测定 DNA 和 RNA 的浓度。</li>
<li>根据制造商说明书，使用随机十聚引物和 SuperScript III 逆转录酶（Invitrogen）从 500–1000 ng RNA 制备 cDNA。</li>
</ol>
5) PCR 与引物延伸实验
<ol>
<li>为每个DNA标记设计两对PCR引物，一对用于基因组DNA扩增，另一对用于cDNA扩增（图2）。将用于cDNA扩增的正向引物和反向引物分别置于不同的外显子中，以避免基因组污染。设计引物时应确保PCR产物长度在100–500 bp范围内。</li>
<li>配制10 μL PCR反应体系，包含0.5 U Immolase Taq（Bioline）、0.8 mM dNTPs、2 mM MgCl2、每种引物0.2 M，以及20 ng的cDNA或DNA模板。每个样本进行四次独立的PCR反应。</li>
<li>在针对每对引物优化的条件下进行PCR扩增，并控制循环次数处于扩增的线性阶段。</li>
<li>通过在37 °C下用外切酶I和虾碱性磷酸酶（SAP）处理PCR产物20分钟，去除多余的PCR引物和dNTPs。</li>
<li>将每个PCR产物在384孔板上点样两次，从而使每个样本可获得8次测量值。</li>
<li>使用Assay Design（Sequenom）软件设计延伸引物，确保同一引物可用于基因组和cDNA的PCR产物。设定引物长度为14–18 bp，并指定延伸反应混合物中包含3ddNTPs的组合（图2）。</li>
<li>按照制造商说明书，使用MassARRAY系统（Sequenom）进行引物延伸反应及MALDI-TOF/MS分析。</li>
<li>典型的引物延伸反应程序包括：94 °C预变性2分钟，随后进行40个循环，每个循环为94 °C 5秒、52 °C 5秒、72 °C 5秒。</li>
<li>使用SpectroCLEAN树脂纯化引物延伸产物，并通过SpectroPOINT纳升级点样仪将产物转移至微阵列芯片上。</li>
<li>使用SpectroREADER质谱仪通过MALDI-TOF技术对延伸后的寡核苷酸进行定量分析。</li>
</ol>
6) 统计分析
<ol>
<li>使用 MassARRAY Typer 软件检查 MALDI-TOF/MS 结果，评估实验的整体质量。</li>
<li>提取包含峰面积数据的等位分型报告。</li>
<li>对每个单独的质谱图，计算等位基因1与等位基因2的峰面积之比（峰面积比）。</li>
<li>针对每个 cDNA 样本，在 Excel 中使用相应函数，基于8次测量结果计算峰面积比的平均值和标准差。</li>
<li>对基因组 DNA 同样基于8次测量结果计算峰面积比的平均值。</li>
<li>将 cDNA 的平均峰面积比除以基因组 DNA 的平均峰面积比，以评估其相对于预期1:1比例的偏离程度。</li>
</ol>
7) 实验对照
<ol>
<li>为排除实验假象，至少重复实验三次。</li>
<li>尽可能设计针对其他DNA标记物的检测方法。</li>
<li>设计多对PCR引物以及可与正链和反链结合的延伸引物。</li>
<li>尽可能使用对DNA标记物呈杂合但不携带与表型相关DNA风险变异的细胞系作为阴性对照（图1和图3）。</li>
</ol>
8) 代表性结果
图3展示了等位基因特异性表达分析的一个示例，并附有质谱图谱的实例。该图显示了在4种不同模板上进行的4个等位基因特异性引物延伸产物的分析结果。上方的图谱表示对两个不同细胞系的基因组DNA分析所得结果，这两个细胞系在转录的编码多态性位点上均为杂合子。然而，只有细胞系A在风险DNA变异位点上为杂合子（图1）。下方的图谱表示从相同细胞系获得的cDNA分析结果。由于实验过程中的技术偏差，即使在基因组DNA分析中，第一个峰也始终高于第二个峰。因此，利用基因组DNA分析的结果对cDNA数据进行标准化处理。标准化后，细胞系A的等位基因比例显著偏离1（其中第二个峰相较于其他图谱明显偏低），而细胞系B的等位基因比例则非常接近于1。该数据表明，细胞系A携带一个与第二个峰所检测等位基因处于相同相位的DNA变异，该变异降低了被分析基因的表达水平。细胞系B则提供了一个非常理想的阴性对照。
<img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="染色体图谱；杂合性比较；细胞系A和B；风险变异；编码标记。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 细胞系筛选策略。 细胞系A和B在转录的编码标记（三角形）上均为杂合状态，但仅细胞系A在风险DNA变异（圆形）上呈杂合。风险变异的蓝色等位基因与较低水平的转录相关（可能是由于其本身具有直接效应，或因其与实际的功能性变异紧密连锁）。
<img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="PCR流程示意图，展示引物延伸至MALDI-TOF/MS分析用于DNA分型。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 等位基因特异性引物延伸检测。 本图展示了针对cDNA（左侧）和基因组DNA（右侧）模板所进行实验流程的工作流程。PCR引物（灰色矩形）设计用于扩增一个杂合编码多态性位点（三角形）。为避免基因组污染，当以cDNA为模板进行扩增时，PCR引物结合于不同外显子中的序列（浅蓝色条带）。PCR产物随后作为模板用于引物延伸反应，该反应使用一条延伸引物，其结合于多态性位点相邻的一个碱基处，并加入适当的三种双脱氧核苷酸（ddNTPs）终止子（方块）和一种脱氧核苷酸（圆形），分别使引物延伸一个或两个碱基。所产生的引物延伸产物具有不同的质荷比，可通过MALDI-TOF质谱技术进行分离与定量。对应于DNA标记蓝色等位基因的产物量相对低于红色等位基因。
<img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="细胞系中等位基因比例的基因组与cDNA比较图；包含统计分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
 图3. 等位基因特异性表达检测结果。 该图显示了对细胞系A和细胞系B（图1）的基因组DNA及cDNA进行分析所获得的质谱结果。

<ol><li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li>
<li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li>
<li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+human+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li>
<li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li>
<li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet+Chapter%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li>
<li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li>
<li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li>
<li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li>
<li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li>
<li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319%2C+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

该方法通过评估疾病相关DNA变异对基因表达的影响，实现对其功能效应的分析 体内 转录水平的等位基因特异性差异。本方案中，通过MALDI-TOF测定相对转录丰度，但也可采用其他可实现等位基因特异性定量的技术，如TaqMan。6,7可以使用。该方法的主要局限性在于转录编码标记的可获得性。已有研究描述了基于此处所述原理但利用不同类别多态性的方法。haploChip检测通过使用位于基因转录起始位点或终止位点1 kb范围内的标记，来测量等位基因特异性表达，这些标记存在于利用RNA聚合酶II特异性抗体富集的染色质免疫沉淀材料中。8或者，当模板为异核RNA时，可使用内含子中的SNP9.
本文所述的特定实验方案结合单倍型芯片（haploChip）检测，已成功用于鉴定出一个与阅读障碍（或称读写能力障碍）相关的候选基因。最初，一项遗传关联研究发现了一段与阅读障碍相关的DNA序列，该序列跨越了三个基因10。等位基因特异性基因表达检测显示，在存在与阅读障碍相关的DNA变异的情况下，仅在这三个基因中的一个基因中观察到表达水平的变化，而其余两个基因则未见表达差异11。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR international</td><td>27788.366</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-500MG</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR international</td><td>100777C</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 逆转录酶</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Immolase Taq</td><td>Bioline</td><td>BIO-21048</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNTP100A</td><td></td></tr><tr><td>外切酶1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>虾碱性磷酸酶</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z</td><td></td></tr><tr><td>SpectroCLEAN 树脂</td><td>Sequenom</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>MassEXTEND ddNTP/dNTP 混合物</td><td>Sequenom</td><td></td><td>根据实验设计而定</td></tr><tr><td>MassEXTEND 热测序酶</td><td>Sequenom</td><td>10052</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>预冷微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectroPOINT 纳升级点样仪</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectroREADER 质谱仪</td><td>Sequenom</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种等位基因特异性基因表达检测法，用于验证遗传关联的功能基础

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

与常见复杂性状显著相关的遗传位点数量正在持续增加。然而，大多数这些关联在分子水平上尚未被阐明。DNA变异影响表型的机制之一是基因表达，研究表明基因表达对复杂性状尤其重要1。
该方法在细胞环境中检测特定DNA序列对基因表达的影响。其原理是通过分析携带一种与疾病相关的DNA序列（即风险变异）拷贝的细胞，来测量来自某个基因两个等位基因的转录本的相对丰度2,3。因此，本方法所用的细胞必须满足两个基本的基因型要求：细胞在DNA风险变异位点和DNA标记位点上均需为杂合状态，其中DNA标记通常是能够区分转录本染色体来源的编码多态性位点（图1）。DNA风险变异与DNA标记的等位基因频率无需相同，但必须明确这些遗传标记之间的相位（单倍型）关系。此外，选择表达目标基因的细胞类型也至关重要。本实验方案具体描述了从成纤维细胞中提取核酸的操作步骤，但该方法同样适用于其他类型的细胞，包括原代细胞。
从选定的细胞系中提取DNA和RNA，并合成cDNA。利用设计用于靶向编码DNA标记物的引物延伸检测方法对DNA和cDNA进行分析4。引物延伸检测根据制造商的说明，使用MassARRAY（Sequenom）5平台进行。随后，通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF/MS）分析引物延伸产物。由于所选标记物为杂合状态，因此在质谱图谱中将产生两个峰。每个峰的峰面积与转录本的丰度成正比，可利用MassARRAY Typer软件中的功能进行测量，从而计算等位基因比例（等位基因1 : 等位基因2）。将cDNA获得的等位基因比例通过基因组DNA测得的等位基因比例进行标准化，后者预期为1:1，以校正技术性偏差。标准化后等位基因比例显著偏离1:1的标记表明，在同一细胞中来自两条染色体的转录本数量存在差异，提示与表型相关的DNA变异可能影响了基因表达。应使用实验对照来验证结果。

表型相关的遗传关联通常在功能层面上仍不明确。本方法旨在通过分析对转录的SNP呈杂合状态的细胞，评估表型相关遗传标记对基因表达的影响。该技术利用MALDI-TOF质谱法精确测量等位基因特异性的引物延伸产物，实现定量分析。

与常见复杂性状显著相关的遗传位点数量正在持续增加。然而，这些关联中的大多数尚未被...

以下实验的总体目标是检测某种特定DNA变异（例如与疾病相关的变异）是否会影响特定基因的表达。该目标通过选择对该变异位点和目的基因中的编码snip均呈杂合状态的细胞系来实现。第二步，从细胞中提取DNA和RNA，并将其用作等位基因特异性引物延伸反应的模板。接下来，通过质谱分析主要的延伸产物，以量化两种等位基因的相对丰度。通过质谱法进行的等位基因特异性定量测量，可获得结果以判断与疾病相关的原始DNA变异是否也与基因表达水平的差异相关。该技术的主要优势在于，与荧光素酶报告基因检测不同，它无需进行分子操作，并且能够检测内源性基因表达水平。此外，我们能够以内部对照的方式比较两个等位基因之间的表达水平，从而消除部分实验变异性。该方法有助于回答人类遗传学领域中的关键问题，例如遗传关联背后的分子机制。当我们在识别出跨越三个基因的遗传关联、却无法将信号精确定位到单个基因时，首次提出了该方法的设想。通过进一步的遗传定位。用于本实验的细胞应表达目标基因，并满足两个基本的基因型要求。细胞必须对与疾病相关的DNA序列以及能够根据染色体来源区分转录本的DNA标记均为杂合状态。在此处所示的细胞系筛选策略中，细胞系A和B对一个转录的编码标记（以三角形表示）均为杂合。然而，Omnicell A 系对与疾病相关的 DNA 序列呈杂合状态，该序列称为风险 DNA 变异型，以圆圈表示。风险变异型的蓝色等位基因与较低水平的转录相关。在根据供应商的说明选择细胞系培养物后，我们将在此演示中使用成纤维细胞。尽管本检测同样适用于其他类型的细胞（包括原代细胞），请分别准备两个 10 厘米的培养皿用于 DNA 和 RNA 的提取。当细胞达到80%融合度时，可采用标准方法（包括适用于所选细胞类型的商业化试剂盒）收获细胞，用于DNA和RNA提取。在进行本实验前，为每个DNA标记设计两对PCR引物：一对用于基因组DNA扩增，另一对用于cDNA扩增；设计cDNA扩增的正向和反向引物时应位于不同的外显子中，以避免基因组污染；引物设计应使每个细胞系的PCR产物长度在100至500个碱基对之间；每次准备八微升的PCR反应体系，其中四次独立反应用于基因组DNA扩增，另四次独立反应用于cDNA扩增。与PCR反应相关的微量组分包含MLA的tack dn、NTPs引物、氯化镁，以及基因组DNA或CD NA。在针对每对引物优化的条件下运行PCR反应，并保持循环次数处于扩增的线性阶段。PCR反应完成后，通过向每个PCR产物中加入核酸外切酶一和虾碱性磷酸酶SAP，并在37摄氏度孵育20分钟，随后在85摄氏度孵育15分钟，以去除PCR引物和过量的DN TPS。将每种PCR产物在384孔板上重复点样两次，以便每份样本获得八个测量值。初筛延伸实验共需16个点样位点。使用检测设计软件设计延伸引物，使其可同时用于基因组DNA和cDNA-PCR产物。引物长度应设定在14至18个碱基对范围内。使用三种脱氧核苷酸终止子和一种脱氧核苷酸的适当混合物进行第一轮延伸反应。典型的第一轮延伸反应包括：94°C下起始变性2分钟，随后进行40个循环，每个循环包括94°C 5秒、52°C 5秒和72°C 5秒。最后，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法，使用光谱读取质谱仪对延伸的寡核苷酸进行定量。本实验方案的一个关键点是采用多种策略控制实验噪声，以排除假象。实验至少重复三次非常重要。该实验的最佳对照是使用对包被SNIP检测具有杂合性的细胞系进行初延伸，但该细胞系不携带与疾病相关的等位基因。此外，应针对替代的DNA转录编码标记设计检测方法。如果这些条件不可行，可通过针对初延伸检测中不同外显子的其他PCR引物对来提供额外的对照。通过设计延伸引物并使其与正向和反向链均发生退火，可提供一个内参对照。此处展示了一个等位基因特异性表达分析的示例，其中包括质谱图谱的实例。该图显示了在四种不同模板上进行的四个等位基因特异性初级延伸产物分析的结果。上方两个图显示了对两个不同细胞系的基因组DNA分析所获得的结果，这两个细胞系在转录编码多态性位点上均为杂合状态。然而，只有细胞系A在风险DNA变异位点上为杂合状态。下方两个图则显示了由相同细胞系产生的cDNA分析结果，该结果源于实验过程中的技术假象。第一个峰始终高于第二个峰，即使在基因组分析中也是如此。因此，使用基因组分析的结果对cDNA数据进行标准化。通过从Mass Array类型的软件中提取所有ELO分型报告来进行统计分析。本报告提供了关于峰面积的数据，此处展示了一个涉及两种细胞系的示例，即细胞A和细胞B，二者在编码区单核苷酸位点上均为杂合状态，但仅细胞A在与疾病相关的标记位点上呈杂合状态。灰色背景的列由软件直接生成，绿色背景的列则针对每种细胞手动计算得出。cDNA和基因组DNA均各有八次测量结果。软件将计算每个光谱峰下方的面积，该面积代表两个等位基因各自的丰度。通过将每个 cDNA 和基因组样本中等位基因一的面积除以等位基因二的面积，计算等位基因比例。在八次测量结果的基础上计算平均值和标准误。较高的标准误（大于0.1）表明测量结果不一致，应予以舍弃。最后，通过基因组DNA的平均比值对cDNA的平均比值进行标准化，以评估其偏离比值1的程度；当等位基因特异性表达无差异时，预期比值为1。细胞A中的标准化比值与1存在差异，而细胞B中的比值接近1，该数据表明细胞系A在相位上携带一个DNA变异，该变异与第二个峰所检测的等位基因相关联，从而降低了被分析基因的表达水平。细胞系B提供了一个非常方便的阴性对照。在尝试本实验流程时，定义具有信息性的遗传变异并设立适当的实验对照至关重要。在完成本流程后，还可采用其他方法，例如单倍型特异性染色质免疫沉淀，这些方法有助于回答诸如在缺乏可转录标记的遗传变异位点处如何分析等位基因特异性基因表达等问题。观看本视频后，您应能充分理解如何以等位基因特异性方式分析 RNA，以及如何利用该方法研究具有重要遗传功能的变异体。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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一种用于研究蛋白质与DNA相互作用、发现基因表达转录调控因子及鉴定新型抗肿瘤药物的定量检测方法

我们提出了一种用于识别影响转录因子（TF）DNA结合的非编码遗传变异的策略性方案和实验流程。本文提供了针对基因型依赖性转录因子DNA结合的电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）的详细实验方案。...

利用电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）筛选功能性非编码遗传变异

我们提供了一种标准化的转录组数据基因集富集分析方案，用于确定适用于转化研究的理想小鼠模型。<br...

使用基因集富集分析确定转化研究中合适动物模型的方案

鉴定参与复杂人类疾病的遗传变异有助于我们发现新的作用机制。本文展示了一种多重基因分型方法，可用于候选基因或基因通路分析，在低成本条件下实现高覆盖度，并适用于基于队列的研究。...

在多重基因分型与质谱技术下的临床队列研究中进行候选基因检测

氨基酸水平的信噪比分析可确定特定氨基酸位点遗传变异的普遍程度，该值已相对于特定人群的背景遗传变异进行标准化。这有助于识别变异 "热点"...

利用氨基酸水平的遗传变异信噪比分析确定变异致病可能性

本方案描述了一种基于重组腺相关病毒（rAAV）的瞬时增强子报告基因检测方法。该检测可用于诱导由增强子驱动的基因表达 体内...

基于增强子的表达载体的AAV递送 在体 小鼠脑中

明暗交替实验是测量小鼠焦虑样行为最常用的实验方法之一。本文展示了一段视频，详细介绍了我们进行该实验的具体操作步骤。...

小鼠明暗转换实验

本实验方案描述了如何从小鼠骨髓中建立原代造血细胞培养，并随后使用 Gene Pulser MXCell...

小鼠骨髓来源的原代造血细胞培养物制备及其电穿孔

用于电生理研究的新生小鼠脊髓分离示例。...

脊髓电生理学

了解等位基因特异性基因表达检测方法，利用MALDI-TOF质谱技术定量分析杂合细胞中的等位基因表达水平。该技术无需分子操作即可直接测量内源性基因表达，为遗传关联的功能机制研究提供可靠手段。

一种等位基因特异性基因表达检测法，用于验证遗传关联的功能基础

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