Name: 在蜜蜂的长鼻扩展响应的经典条件反射行为药理学（蜜蜂） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学习利用经典条件反射方法研究蜜蜂（Apis mellifera）学习与记忆的分子机制。该方法通过系统性药物注射揭示认知过程的神经生物学基础，为行为神经科学提供可靠的研究手段。

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本研究得到了德国联邦教育与研究部（BMBF）在“伯恩斯坦学习神经基础重点研究项目”（BFNL）中向 D.E. 提供的资助。我们感谢 Randolf Menzel 对本文早期版本提出的宝贵意见。

1. 从蜂巢中捕捉蜜蜂
<ol>
<li>实验开始前一天的下午2至4点，捕捉离开蜂巢的蜜蜂。操作时，将一个可透过紫外线的透明聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）金字塔形装置（高 = 30 cm，顶端 3.5 × 3.5 cm，底面 18 × 18 cm），其顶端和底端均可封闭，放置在蜂巢入口前方20–30 cm处，底端开口朝向蜂巢，顶端关闭，使离开蜂巢的蜜蜂进入金字塔的底端。随后关闭底端，将捕获的蜜蜂带回实验室进行后续处理。</li>
</ol>
2. 将蜜蜂从金字塔装置转移至玻璃小瓶中
<ol>
<li>在实验室中，将金字塔形装置底面朝下放置。用毛巾等物品遮盖金字塔的侧壁使其变暗，但顶端保持暴露。由于蜜蜂具有正趋光性，打开装置后蜜蜂会从顶端飞出。通过将玻璃小瓶置于打开的顶端上方，可逐只将蜜蜂转移至小瓶中。每只蜜蜂使用一个独立的小瓶，因此当一只蜜蜂进入小瓶后，应立即关闭顶端。</li>
</ol>
3. 利用管中蜜蜂
<ol>
<li>将蜜蜂置于冰上的玻璃小瓶中冷却 2.5–3.5 分钟以使其 immobilized（固定）。建议观察蜜蜂状态，一旦其停止活动，立即从冰上取出。</li>
<li>将一只已固定的蜜蜂用胶带固定在小型塑料管中，使其能够自由活动喙，但头部、胸部和腿部不能移动。注意不要压迫其颈部。</li>
<li>每只固定在塑料管中的蜜蜂均放入支架上的编号孔洞中，以便于操作和识别。每次取出进行条件训练或记忆提取后，必须将该塑料管准确放回原来的同一孔洞中。</li>
</ol>
4. 喂食蜜蜂
<ol>
<li>在第一天傍晚（16:00–18:00）捕捉蜜蜂后，用蔗糖溶液（0.88 M，将精制白砂糖溶解于自来水制得）饲喂至饱足。饲喂时，用蔗糖溶液触碰蜜蜂的触角以诱发其 proboscis extension response（PER，喙伸展反应），随后让蜜蜂摄取一滴蔗糖溶液（4 μL）。需逐只反复饲喂蜜蜂，直至其触角接触蔗糖溶液时不再迅速且可靠地表现出 PER 为止。</li>
<li>在实验期间的每个后续傍晚（16:00–18:00），蜜蜂需逐只饲喂四次，每次一滴蔗糖溶液（4 μL，0.88 M，将精制白砂糖溶解于自来水制得）。饲喂过程中应避免将蔗糖溶液涂抹在蜜蜂的触角或喙部，同时确保移液管不被蔗糖溶液污染。蜜蜂的饲喂地点不应在条件化训练场所或其附近进行，以避免蜜蜂将训练环境与蔗糖刺激建立关联。</li>
</ol>
5. 过夜保持束缚蜜蜂
<ol>
<li>将蜜蜂置于塑料碗中，在室温下饲养过夜。向碗中加入自来水（水位约0.5–1 cm高）。利用ELISA板作为平台，将装有束缚蜜蜂的架子置于水面以上。最后，用纸板盖住塑料碗。</li>
</ol>
6. 嗅觉条件反射
在实验的第一天上午（10点）进行嗅觉条件化训练。条件刺激（CS）为一种气味，非条件刺激（US）为蔗糖溶液。
<ol>
<li>用移液器吸取 4 μL 气味物质（例如丁香油），滴加到一张圆形滤纸（直径 1.3 cm）上，然后将滤纸放入一支 20 mL 注射器中。操作应在通风橱内进行，并使用滤芯吸头以防止移液器被污染。</li>
<li>将固定好蜜蜂的支架在训练开始前 30 分钟放置于训练区域附近，但需与单只蜜蜂接受训练的排气管前方位置保持一定距离。</li>
<li>训练包括三次气味（条件刺激，CS）与蔗糖溶液（非条件刺激，US，1.25 M）的配对，每次试验之间间隔（ITI）为 10 分钟。通过音频播放器向实验者提供声音信号，以确保刺激开始、结束、持续时间及放置动作的精确计时。每次习得试验开始时，先将蜜蜂置于排气管前 10 秒；在 10 秒即将结束前，将装有气味的注射器置于蜜蜂触角前方 3 cm 处；随后通过推动 20 mL 空气使气味持续释放 5 秒。在气味释放开始后的第 3 秒，用蘸有蔗糖溶液的牙签轻触蜜蜂双侧触角的远端鞭节，并让蜜蜂舔舐湿润的牙签 4 秒。在条件刺激（CS）结束后 13 秒，将蜜蜂移出训练环境并放回支架中。整个训练过程持续 28 秒。 
需要注意的是，训练后蜜蜂的触角或喙部不得残留蔗糖。因此必须确保牙签仅轻微湿润于蔗糖溶液，且表面不可形成液滴。</li>
<li>训练结束后，将支架重新放回容器中。</li>
<li>实验过程中，实验者需观察并记录蜜蜂的行为，即在放置过程中以及条件刺激（CS）和非条件刺激（US）呈现期间是否出现伸吻反应（PER）。</li>
</ol>
7. 记忆保持
<ol>
<li>可在任意时间间隔（分钟至天）进行保持测试。测试开始前 30 分钟，将装有蜜蜂的架子放置在训练地点附近。</li>
<li>记忆测试包括 5 秒条件刺激（CS）呈现，不伴随非条件刺激（US）呈现。测试开始时，先将蜜蜂置于通风口前 10 秒，随后按上述方法呈现 5 秒气味。在放置期间及条件刺激呈现期间，记录蜜蜂的行为，即是否出现喙伸展反应（PER）。</li>
<li>实验结束时，再次用蔗糖溶液触碰蜜蜂的触角以诱发喙伸展反应，确保蜜蜂仍具备伸展喙的能力。</li>
</ol>
8. 全身注射
全身注射的时间点取决于实验设计。
<ol>
<li>使用一次性皮下注射针（21 G）在盾片后部靠近飞行肌上方盾缝的角质层处打一个小孔17。</li>
<li>通过角质层上的小孔，用玻璃毛细管将1 μL溶液注入飞行肌内。经过训练的实验人员每30秒可注射一只蜜蜂，从而实现对注射和条件化时间的精确控制。</li>
</ol>
9. 实验期间蜜蜂的饲喂
<ol>
<li>在训练后的傍晚（16:00–18:00），将蜜蜂逐一喂食蔗糖溶液（4 μL，0.88 M，白砂糖溶于自来水）共四次，每次一滴。喂食过程中需注意避免将蔗糖溶液沾染到蜜蜂的触角或喙部，同时确保移液管不被蔗糖溶液污染。为避免蜜蜂将训练环境与蔗糖刺激建立关联，喂食不应在训练地点或其附近进行。</li>
</ol>
10. 数据收集与数据分析
<ol>
<li>实验过程中监测蜜蜂是否出现 proboscis 延伸反应。若蜜蜂在条件刺激（CS）开始后至非条件刺激（US）呈现前（训练阶段）或仅在条件刺激（CS）呈现期间（测试阶段）伸出其 proboscis 并越过上下颚之间的虚拟线，则记为阳性反应。</li>
<li>纳入分析的个体需满足两个标准：必须在整个实验过程中存活，并且在实验结束时对蔗糖溶液表现出非条件性的 proboscis 延伸反应（PER）。针对每次条件刺激（CS）的呈现，分别绘制在习得和保持测试中表现出 PER 的蜜蜂百分比。</li>
</ol>
11. 代表性结果：
本文展示了两个实验。
在第一个实验中，我们观察了磷酸盐缓冲盐水（PBS；单位：mM：137 NaCl，2.7 KCl，10.1 Na2HPO4，1,8 KH2PO4，pH 7.2）对学习和长期记忆形成的影响。将蜜蜂分为三组，每组进行三次条件刺激-非条件刺激（CS-US）配对训练，组间间隔为10分钟：未处理组、注射了 1 μL PBS组在训练前30分钟注射PBS，假注射组除不注射PBS外其余处理与PBS组相同。训练后24小时，对所有三组动物通过一次条件刺激呈现测试记忆。在三次训练试验中，表现出条件反应的动物比例显著增加（图1，重复测量方差分析的时间因素F）2,378=340,456, p &lt; 0.05）。在条件化过程中，三组之间的PER未观察到差异（重复测量方差分析的组间因素F2, 189 = 1.299，p &gt; 0.05）。这一结果在24小时保持测试中同样成立（F2, 187 = 0.752, p&gt;0.05）时，未处理动物与PBS注射动物及假手术注射动物相比。
在第二次实验中，我们证明了在训练后30分钟系统注射蛋白质合成抑制剂茴香霉素（10 mM）可抑制训练后第三天和第四天的记忆保持。在记忆保持测试中，与注射PBS的对照组相比，注射茴香霉素的实验组表现出显著差异（图2，重复测量方差分析显示组间效应F1, 94=8.86，p &lt; 0.05）。在第3天和第4天的记忆测试中可观察到明显差异。该结果与Wüstenberg et al.18的研究结果相似，后者同样采用三次条件刺激-非条件刺激配对对蜜蜂进行条件化训练，但实验方案有所不同。
<img src="/files/ftp_upload/2282/2282fig1.jpg" alt="显示习得与记忆保持的折线图；不同处理组中 %PER 随时间的变化" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 表皮损伤或注射 PBS 不影响习得及记忆保持。 动物接受三次条件刺激-非条件刺激配对训练（习得）。24 小时后测试记忆（记忆保持）。训练前 30 分钟，对两组动物在表皮上打孔（损伤组、PBS 组），其中一组注射 1 μL PBS（PBS 组）。第三组动物不做任何处理（无处理组）。图中显示各组动物在气味刺激下发生伸吻反应（PER）的百分比。方差分析（ANOVA）显示，各组在习得阶段（F2, 189 = 1.299, p &gt; 0.05）和记忆保持阶段（F2, 187 = 0.752, p &gt; 0.05）均无显著差异。
<img src="/files/ftp_upload/2282/2282fig2.jpg" alt="显示在获得阶段和记忆保持阶段的% PER的图表，包含PBS和Aniso条件。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 在最后一次条件刺激-非条件刺激配对后40分钟注射茴香霉素，可使训练后第三天和第四天的记忆保持显著降低。 动物接受三次条件刺激-非条件刺激配对训练（获得阶段），并在首次训练试验后1小时，注射1 μL 10 mM茴香霉素（Aniso）或1 μL PBS。分别在24小时、48小时、72小时和96小时后检测记忆保持情况。图中显示的是每组动物在气味刺激下表现出伸吻反应（PER）的百分比。方差分析（ANOVA）结果显示，训练后72小时和96小时，注射茴香霉素显著降低了记忆保持水平（F1, 94=8.86, p &lt; 0.05）。

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<li>Wustenberg, D., Gerber, B., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+communication%3A+long-+but+not+medium-term+retention+of+olfactory+memories+in+honeybees+is+impaired+by+actinomycin+D+and+anisomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Short communication: long- but not medium-term retention of olfactory memories in honeybees is impaired by actinomycin D and anisomycin.</a> Eur. J. Neurosci. 10, 2742-2745 (1998).</li>
<li>Vollbehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+Orientierung+junger+Honigbienen+bei+ihrem+1%5BTitle%5D)+AND+%22Orientierungsflug.+Zool.+Jb.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Zur Orientierung junger Honigbienen bei ihrem 1.</a> Orientierungsflug. Zool. Jb. Physiol. 79, 33-69 (1975).</li>
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</ol>

无利益冲突声明。

<ol>
<li>捕捉蜜蜂：为采集有经验的采集蜂，可在早晨或下午进行捕捉，避免在幼蜂进行定向飞行的时段操作19。采集蜂分为采集花粉和采集花蜜两类。根据其对糖的敏感性及学习能力的不同，已观察到花粉采集蜂与花蜜采集蜂之间存在差异20。为仅捕捉花蜜采集蜂，可在蜂巢附近设置装有蔗糖溶液的人工食物源，并在该处收集蜜蜂。返回蜂巢的花粉采集蜂可通过其后足上的花粉篮加以识别20。</li>
<li>固定与操作：应避免将蜜蜂长时间置于冰上冷却，因其可能影响蜜蜂的学习能力及实验结束前的存活率。将蜜蜂足部固定于管内时需小心操作，以防足部意外接触蔗糖溶液而产生刺激。这一点至关重要，因为已有研究表明，蜜蜂可通过足部接触蔗糖溶液而形成学习记忆3,21。</li>
<li>嗅觉条件化训练：条件化训练的次数、试验间间隔以及测试时间点可根据研究重点进行调整3,22。</li>
<li>饲喂：已知蜜蜂的饱食程度会影响其学习表现和记忆保持能力3,23，因此在实验设计时必须考虑这一因素。</li>
<li>注射：蜜蜂胸部存在气囊17，这些结构是呼吸系统的重要组成部分，对生存至关重要。因此在注射过程中应小心避免损伤气囊。若出现气泡释放，则提示气囊已受损。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>20 毫升 Omnifix 注射器</td><td>B. Braun Medical</td><td>4616200 V</td><td></td></tr><tr><td>精制白砂糖（家用）</td><td>Kaisers 超市，德国柏林</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁香油</td><td>Bombastus，德国弗赖塔尔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multipette plus 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>4981 000.019</td><td></td></tr><tr><td>30 孔蜜蜂管架</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料管</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透紫外光的亚克力金字塔</td><td>自制</td><td></td><td>高 = 30 厘米，顶部 3.5 × 3.5 厘米，底部 18 × 18 厘米</td></tr><tr><td>胶带</td><td>Tesa，德国汉堡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillator 加样棒 1-5&amp;mu;l</td><td>Selzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillator 吸头 1-5&amp;mu;l</td><td>Selzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤纸，厚度 0.16–0.2 毫米</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 616 或 MN615</td><td>裁剪为直径 1.3 厘米的圆形片</td></tr><tr><td>一次性皮下注射针头</td><td>B. Braun Medical</td><td>4657683</td><td>直径 0.45 毫米</td></tr></tbody></table>

蜜蜂（apis mellifera）喙伸展反应经典条件反射中的行为药理学研究

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

蜜蜂（Apis mellifera）以其出色的交流能力、定向能力和强大的学习能力而闻名1,2。由于蜂群的生存依赖于对食物资源的利用，采集蜂会学习并记忆不同花朵的位置及其回报价值。在自然环境中，采集蜂可在觅食点被轻松训练，学习与食物相关的信号，如气味或颜色。此外，在实验室条件下，通过训练个体束缚的蜜蜂产生喙伸展反应（proboscis extension response, PER），也可研究其趋利性关联学习3,4。该学习范式能够以简单且高度可靠的方式，研究学习与记忆形成背后的神经元和分子机制5-12。行为药理学方法常用于研究分子机制，通过系统注射药物，在学习和记忆形成过程中或之后干扰特定分子的功能13-16。
本文展示了如何利用束缚法对蜜蜂进行PER条件化训练，以及如何通过向蜜蜂飞行肌注射药物实现全身给药。

我们展示了如何通过系统性给药的方式，在蜜蜂（Apis mellifera）的趋性嗅觉条件化范式中实施行为药理学方法。该方法能够以简单且可靠的方式研究学习与记忆形成的潜在机制。

蜜蜂（Apis mellifera）喙伸展反应经典条件反射中的行为药理学研究

蜜蜂（Apis mellifera）以其出色的交流与定向能力以及强大的学习能力而闻名1,2。由于……

本实验的总体目标是研究学习与记忆形成的分子机制。在蜜蜂中，第一步是从蜂巢中采集自由飞行的蜜蜂。接下来，将蜜蜂固定在塑料管中。 该实验步骤的第三步是进行经典条件反射训练。可以在条件反射训练前后的特定时间点注射药物，以研究这些药物对学习和记忆形成的影响。该实验步骤的最后一步是测试记忆保持能力。最终，药物处理后行为的变化可能揭示学习和记忆形成的分子机制。在蜜蜂中，该方法可通过揭示记忆形成的分子机制，帮助回答学习与记忆领域的关键问题。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为在条件刺激和记忆提取过程中，刺激呈现的时间必须精确。此外，喂养方案也至关重要。本实验流程将由剪切齿轮装置和约翰内斯·法伯格（Johannes Faberg）向我实验室的研究生进行演示。实验前一天下午两点至四点之间，使用可透过紫外光的有机玻璃金字塔收集蜜蜂。返回实验室后，将金字塔形装置底面朝下放置，用毛巾遮盖四周壁面，仅留顶端开口。打开顶端，将玻璃小瓶置于开口上方，使一只蜜蜂进入瓶内后立即重新封口。在秋季和冬季，重复此操作，直至所有蜜蜂均被转移至玻璃小瓶中。当蜜蜂不在外界飞行时，将蜂箱置于温室内的网罩中，直接从网罩中捕捉单只蜜蜂。每只蜜蜂使用一个玻璃小瓶，通过将小瓶在冰上冷却 2.5 至 3.5 分钟来使其 immobilize（固定）。密切观察蜜蜂，一旦其停止活动，立即将其从冰上取出。用胶带将蜜蜂固定在小型塑料管内。确保蜜蜂的腹部可以自由活动，但头部、胸部和足部不能移动。同时注意不要压迫其颈部。蜜蜂准备就绪后，将试管放入支架上编号的孔洞中，以便于操作和识别。每次都将管子放回相同的孔洞中。处理后，应在与训练地点不同的位置，于下午4点至6点之间饲喂蜜蜂。通过触碰蜜蜂及其触角，诱发其喙伸展反应（PER）。使用蔗糖溶液，让蜜蜂摄取约四微升的SRAs溶液一滴。注意不要弄脏蜜蜂的触角、口器或塑料管。每只蜜蜂喂食至其不再摄食为止。当它们的触角接触到溶液时，表现出快速且可靠的伸吻反应。在实验的后续几天晚上，每次用一滴蔗糖溶液喂食每只蜜蜂，共喂食四次。用自来水将一个塑料碗填充至约0.5到1厘米高。将装有束缚蜜蜂的架子放在碗中，并以裂解板作为平台。用纸板盖住碗，于室温下过夜存放。蜜蜂在采集后的第二天上午约10:00进行嗅觉条件化训练。实验开始前30分钟，将束缚蜂的架子放置在训练地点附近，但需远离蜜蜂训练时所用的排气管开口处。接着，在通风橱内准备条件刺激物。使用带滤芯的吸头将四微升丁香油滴加到圆形滤纸上。将带有香味的滤纸放入一个20毫升的注射器中，并插入活塞。设置音频播放器，以便向实验人员传递声学信号。这可确保刺激的精确时序，包括刺激起始、刺激终止、持续时间及位置。准备在条件反射训练期间全程记录蜜蜂的行为。若蜜蜂在条件刺激开始后到无条件刺激呈现前伸出了其口器（SSIS），则记为阳性得分。当蜜蜂穿过张开的上颚之间的虚拟线时，开始采集试验。选择一只需要训练的蜜蜂，将其置于排气口前方，持续10秒。在此10秒间隔即将结束前，将装有气味的注射器放置在距离蜜蜂及其触角3厘米的位置。通过推动20毫升空气经过注射器，持续5秒，以释放气味刺激。三秒后，用蘸有蔗糖溶液的湿润牙签触碰蜜蜂两根触角远端鞭节的腹面，以引入非条件刺激。注意避免将溶液沾到蜜蜂身体和触角上，随后让蜜蜂舔舐牙签。该复合刺激持续四秒，之后将蜜蜂从训练环境中移出，放回支架中。在呈现条件刺激后13秒，一次训练试验持续28秒。两次试验之间间隔10分钟，将蜜蜂重新放回训练地点。按照之前所示方法进行第三次试验中的第二次试验，在完成最后一次配对前再等待10分钟。当天训练结束后，将蜂架放回容器中。请记住，在下午4点至6点之间，用一滴4微升的蔗糖溶液，每只蜜蜂需饲喂四次。如前所述，可在训练后的数分钟至数天内任意时间间隔进行记忆保持测试。进行记忆测试前，需将蜂架放置在训练地点附近30分钟以作准备。将一只蜜蜂置于排气口前方10秒以开始测试。随后给予条件刺激5秒，并记录是否出现伸吻反应（PER）。当日测试结束后，将架子重新放回培养皿中。请记住，在整个实验结束前的下午4点至6点之间，用一滴4微升的蔗糖溶液对每只蜜蜂进行四次饲喂。如前所述，在实验结束时，用SRA溶液触碰蜜蜂的触角，以检测其是否仍能伸展喙，从而判断其是否具备完整的PER（喙伸展反射）。只有在整个实验过程中存活且PER反应完整的蜜蜂，方可纳入分析。在某些研究中，采用全身注射的方法来研究药理学干预对嗅觉记忆的影响。根据实验设计的不同，这些注射可在不同时间点进行。首先，使用一次性皮下注射针在S型滑行虫后部外骨骼靠近飞行肌上方S型滑行缝处刺一个小孔。接着，用待测溶液填充一根玻璃毛细管，体积为一微升。将毛细管插入外骨骼的小孔中，并将溶液注入飞行肌内。经过训练的实验人员每30秒可注射一只B，从而实现对注射和条件化时间的精确控制。本文展示了两个实验。第一个实验考察了训练前系统性注射生理盐水对记忆学习的影响。本研究包含三组：不接受任何处理的对照组、接受一微升磷酸盐缓冲液全身注射的实验组，以及假处理组。这些处理均在训练开始前30分钟进行，如左侧所示。在习得阶段的三次训练试验中，表现出条件反应的动物百分比逐渐增加，且各组之间无显著差异。右侧的柱状图显示，PBS 注射和假性损伤均未影响记忆保持。在第二次实验中，训练后 24 小时给予注射，注射在训练后 40 分钟进行，蜜蜂被分为两组，一组接受生理盐水，另一组接受一微升（1 µL）蛋白质合成抑制剂红霉素（anisomycin）。右侧柱状图显示，接受红霉素的蜜蜂其记忆保持能力明显下降。这些结果凸显了蛋白质合成在嗅觉记忆形成中的重要性。通过该方法，可进行电生理和电生理记录，以回答更多问题，例如学习与记忆形成的神经生理学基础在发育后是什么？该技术为学习与记忆研究领域的研究人员探索蜜蜂记忆形成过程中的分子与神经生理学机制铺平了道路。

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科研

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神经科学

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