蜜蜂（Apis mellifera）喙伸展反应经典条件反射中的行为药理学研究

本实验的总体目标是研究学习与记忆形成的分子机制。在蜜蜂中，第一步是从蜂巢中采集自由飞行的蜜蜂。接下来，将蜜蜂固定在塑料管中。

该实验步骤的第三步是进行经典条件反射训练。可以在条件反射训练前后的特定时间点注射药物，以研究这些药物对学习和记忆形成的影响。该实验步骤的最后一步是测试记忆保持情况。

最终，药物处理后行为的变化可能揭示学习和记忆形成的分子机制。在蜜蜂中，该方法通过揭示记忆形成的分子机制，有助于回答学习与记忆领域的关键科学问题。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为在条件刺激和记忆提取过程中，刺激呈现的时间必须精确。此外，喂养方案也至关重要。本实验流程将由剪切齿轮和约翰内斯·法伯格向我实验室的研究生进行演示。在实验前一天下午两点至四点之间，使用可透过紫外光的有机玻璃金字塔收集蜜蜂。

返回实验室后，将金字塔放置在底座上，用毛巾遮盖四周壁面，仅暴露顶端。打开顶端，将一个玻璃小瓶置于开口上方，使单只蜜蜂进入小瓶后立即重新封口。在秋季和冬季，重复此操作，直至所有蜜蜂均被转移至玻璃小瓶中。

当蜜蜂不在外界飞行时，将蜂箱置于温室内的网罩中，直接从网罩中捕捉单只蜜蜂。每只蜜蜂使用一个玻璃小瓶，通过将小瓶在冰上冷却 2.5 至 3.5 分钟来使其 immobilize（固定）。密切观察蜜蜂，一旦其停止活动，立即将其从冰上移开。

用胶带将固定好的蜜蜂束缚在一个小型塑料管内。确保蜜蜂的口器可以自由活动，但头部、胸部和足部不能移动。同时注意不要压迫其颈部。

蜜蜂准备就绪后，将试管放入支架上编号的孔洞中，以便于操作和识别。

将管子始终放回同一钻孔中。处理后，在与训练地点不同的位置，于下午4点至6点之间饲喂蜜蜂。通过触碰蜜蜂及其触角来诱发其喙伸展反应（PER）。

使用蔗糖溶液，让蜜蜂摄取一滴约四微升的SRAs溶液。注意不要污染蜜蜂的触角、口器或塑料管。每只蜜蜂喂食至其不再摄取为止。

当蜜蜂的触角接触到溶液时，表现出快速且可靠的伸吻反应。在实验的后续几天晚上，每次用一滴蔗糖溶液喂食每只蜜蜂，共喂食四次。用自来水将一个塑料碗填充至约0.5到1厘米高。

将装有束缚蜜蜂的架子放在碗中，并以裂解板作为平台。用纸板盖住碗，于室温下过夜保存。蜜蜂在采集后的第二天上午约10:00进行嗅觉条件化训练。

实验开始前30分钟，将束缚蜂的架子放置在训练地点附近，但需远离蜜蜂训练时所用的排气管开口处。接着，在通风橱内准备条件刺激物。

使用带滤芯的吸头将四微升丁香油滴加到圆形滤纸上。将带有香味的滤纸放入一个20毫升的注射器中，并插入活塞。设置音频播放器，以便向实验人员传递声学信号。

这可确保刺激的精确时序，包括刺激起始、刺激终止、持续时间及位置。准备在条件反射训练期间全程记录蜜蜂的行为。若蜜蜂在条件刺激开始后、非条件刺激呈现前伸出了其口器（SSIS），则记为阳性得分。

当蜜蜂穿过张开的上颚之间的虚拟线时，开始一次采集试验。选择要训练的蜜蜂，并将其置于排气口前方，持续10秒。在此10秒间隔即将结束前，将装有气味的注射器放置在距离蜜蜂及其触角3厘米处。通过推动20毫升空气经过注射器，持续5秒，以呈现气味刺激。

三秒后，用蘸有蔗糖溶液的湿润牙签触碰蜜蜂两根触角远端鞭节的腹面，以引入非条件刺激。注意避免将溶液沾到蜜蜂身体和触角上，随后让蜜蜂舔舐牙签。该复合刺激持续四秒，之后将蜜蜂从训练环境中移出，放回架子中。

在呈现条件刺激后13秒，一次训练试验持续28秒。两次试验之间间隔10分钟，将蜜蜂重新放回训练位置。按照之前所示方法进行第三次试验中的第二次试验，并在进行最后一次配对前再等待10分钟。

当天训练结束后，将蜂架放回容器中。请记住，在下午4点至6点之间，用一滴4微升的蔗糖溶液，每只蜜蜂需饲喂四次。如前所述，可在训练后的数分钟至数天内任意时间间隔进行记忆保持测试。进行记忆测试前，需将蜂架放置在训练地点附近30分钟以作准备。

通过将蜜蜂置于排气口前方10秒开始测试。随后呈现条件刺激5秒，并记录是否出现伸吻反应（PER）。当日测试结束后，将支架重新放回容器中。

请记住，在整个实验结束前的下午4点至6点之间，每只蜜蜂需用一滴4 µL的蔗糖溶液喂食四次。如前所述，在实验结束时，用SRA溶液触碰蜜蜂的触角，检测其是否仍能伸出口器（proboscis），以确认其是否纳入分析。用于分析的蜜蜂必须全程存活，且具有完整的口器伸展反射（PER）。在某些研究中，采用全身注射的方法来研究药理学干预对嗅觉记忆的影响。根据实验设计的不同，这些注射可在不同时间点进行。

首先，使用一次性皮下注射针在S小脑后部靠近飞行肌上方S小脑裂的角质层处刺一个小孔。接着，用待测溶液填充一根玻璃毛细管，容量为一微升。将毛细管插入角质层的小孔中，并将溶液注入飞行肌内。

经过训练的实验人员每30秒可注射一只B，从而实现对注射和条件化时间的精确控制。本文展示了两个实验。第一个实验考察了训练前系统性注射生理盐水对记忆学习的影响。

本研究包含三组：不接受任何处理的对照组、接受一微升磷酸盐缓冲液系统注射的处理组，以及假手术组。这些处理均在训练开始前30分钟进行，如左侧所示。在习得过程中，三组动物在三次训练试验中表现出条件反应的比例均逐渐上升，且组间无显著差异。

右侧的柱状图显示，PBS注射和假性损伤均未影响记忆保持。在第二次实验中，训练24小时后，于训练结束40分钟时进行注射，蜜蜂被分为两组：一组接受生理盐水，另一组接受一微升（1 µL）蛋白质合成抑制剂红霉素（anisomycin）。右侧柱状图显示，接受红霉素的蜜蜂其记忆保持能力明显下降。这些结果凸显了蛋白质合成在嗅觉记忆形成中的重要性。

通过该实验流程，可进行电生理和电生理记录，以回答更多问题，例如学习与记忆形成的神经生理学基础在发育之后是什么？该技术为学习与记忆研究领域的科研人员探索蜜蜂记忆形成过程中的分子与神经生理学机制奠定了基础。