X射线晶体学的蛋白质结晶

本实验的总体目标是制备可用于X射线衍射实验的蛋白质晶体。本文展示了三种不同的晶体筛选技术，包括悬滴法和坐滴法在内的蒸气扩散结晶法，以及微批量结晶法。在蒸气扩散结晶法中，将沉淀剂加入到孔中。

然后将高浓度的纯化蛋白质样品与沉淀剂混合。将混合后的液滴密封在含有沉淀剂溶液的孔中。微批量结晶通过在孔中加入石蜡油开始。

然后将蛋白质加入到孔中，接着加入沉淀剂溶液。所有方法的最后一步是让体系达到平衡，并观察液滴中晶体的出现和生长情况。最终，可通过该技术获得晶体，并利用配备合适探测器的X射线源测定蛋白质的衍射图谱。

大家好，我是来自耶鲁大学分子生物物理学与生物化学系Yoga Motis教授实验室的Sal。今天我们将向您展示一种纯化蛋白质的结晶方法。我们实验室利用该方法研究病毒感染的结构基础。

那么，让我们开始培养一些晶体。为了确定目标大分子的结晶方法，可使用市售的结晶溶液进行初步筛选，这些溶液的选择基于稀疏矩阵不完全因子法的试验条件。这些条件是根据已知且通常成功的大分子结晶条件而选定的。

一旦确定了结晶条件，便可围绕初始的阳性条件，在沉淀剂浓度和pH值附近设计一个精细筛选实验。通常，此类筛选所用的结晶条件包含一种沉淀剂和一种用于设定pH值的缓冲液；所有储备溶液在此演示中均须通过0.22微米滤膜过滤。本实验采用先前确定的鸡溶菌酶结晶条件，以氯化钠作为沉淀剂；首先配制1毫升不同浓度的氯化钠溶液，溶于0.1摩尔的醋酸钠缓冲液中，并调节至不同的pH值。

接下来，将保存在-80摄氏度的蛋白质样品解冻，并置于冰上保持低温。典型的蛋白质浓度范围为每毫升5至50毫克，通常浓度越高，结果越好。此处使用的是50毫克/毫升的溶菌酶溶液（来自鸡蛋清），溶剂为0.02摩尔/升、pH 4.9的醋酸钠缓冲液。

在 18,000 G 和 4 °C 条件下离心样品 15 分钟，以去除解冻步骤中可能产生的部分聚集蛋白或沉淀物。这些聚集体可能干扰晶体生长并促进进一步聚集。离心结束后。

使用紫外光谱光度计，根据蛋白质在280纳米处的吸光度测定其蛋白浓度。蛋白浓度可通过吸光度读数和该蛋白的消光系数计算得出。待蛋白样品准备就绪后，按照结晶板布局图，向24孔悬滴结晶板中每孔加入500微升沉淀剂溶液。

在每个孔的边缘涂抹一圈硅脂，但不要完全闭合该环，以便孔内空气能够逸出。使用压缩空气喷雾或专业擦拭纸清洁盖玻片，以避免灰尘污染，这有助于更好地观察结晶液滴并消除杂质。下一步是用移液器将等体积的蛋白质样品和储液溶液滴加到盖玻片上。

然而，在优化过程中，可以尝试使用不同体积的蛋白质和沉淀剂；当蛋白质体积大于沉淀剂时，平衡后的液滴中蛋白质会净浓缩，这可能有利于低浓度的蛋白质样品，或用于减缓晶体成核或生长。本演示中，在盖玻片中央加入两微升浓度为每毫升50毫克的溶菌酶（溶于0.02摩尔的醋酸钠溶液，pH 4），随后加入两微升结晶溶液。

将蛋白质溶液和储液加入盖玻片时，需格外小心以避免产生气泡，气泡通常在移液枪排出空气时形成。应轻柔混合液滴，以防止因液滴内局部沉淀剂浓度过高而导致蛋白质过早沉淀；对于聚乙二醇等黏稠沉淀剂，此混合步骤尤为重要，可使用镊子操作。轻轻翻转盖玻片，并将其以定向方式放置于井口上方的油脂环上，使空气能够顺利从井中逸出。

否则，空气可能顶起盖玻片，破坏孔板密封。继续操作至下一个孔，直至完成整块板。板设置完成后，需进行目视检查，清除灰尘颗粒及其他污染物，以减少蛋白晶体的假阳性鉴定。

使用评分表记录实验。接下来，将托盘置于所需的孵育温度下，通常为 4 摄氏度至室温之间。最成功的温度为 20 摄氏度。

转移或孵育过程中，请小心轻柔地操作培养板，避免任何晃动、振动或温度变化，以免影响晶体生长或降低晶体质量。次日检查培养板中的晶体情况，之后每隔几天检查一次，始终小心操作培养板。将所有观察结果及液滴形态记录在培养板专用的评分表中。

晶体通常在两到五天内出现，但有时会几乎立即出现，或延迟至数月后才出现。一旦确定了结晶条件并了解了晶体的生长速度，最好在晶体出现并生长至最终大小的一半以上之前，保持培养板静置不动。保持培养板静置可减少晶体成核事件的次数，从而获得数量更少但尺寸更大的晶体。坐滴法结晶的操作步骤与悬滴法相同，区别在于使用24孔坐滴板，且无需盖玻片。

相反，孔内含有一个平台，用于混合蛋白质和沉淀剂。用移液器将两微升浓度为50毫克/毫升的溶菌酶溶液加入平台中央，避免产生气泡。接着，在设置好板架后，向样品中加入两微升沉淀剂溶液。使用光学封板膜对悬滴法孔板进行密封。

无需盖玻片。继续按照悬滴法所述进行孵育和晶体评分。以执行微批量实验步骤。

按照悬滴法所述方法制备结晶溶液和蛋白质。取一个新的微批量筛选板，并用空气喷雾清洁以避免微批量筛选板中存在灰尘和其他大颗粒。向每个孔中加入石蜡油，深度达三毫米。

然后去除多余的油。接下来，将一微升蛋白溶液加入预装有溶液的孔中，确保液滴沉入孔底。然后向孔中加入一微升沉淀剂溶液。

确保液滴沉入孔底并与蛋白质液滴融合。逐孔操作直至完成整块板，随后按照此处所述继续孵育和晶体分析。蛋白质结晶的典型结果。

实验结果如图所示。当蛋白质和/或沉淀剂浓度较高时，会形成无定形沉淀。相反，未饱和的液滴通常保持澄清。

当蛋白质或去垢剂在高浓度下与某些沉淀剂混合时，可能会发生相分离现象。在最佳条件下，蛋白质晶体应形成拟南芥 csn。在聚乙二醇 8,000 和乙酸镁中获得的七个蛋白质晶体呈棒状。

图中所示晶体为溶酶体蛋白晶体，该晶体在1摩尔的氯化钠和醋酸钠、pH 4.9条件下获得。此延时录像显示，采用悬滴法时，溶酶体晶体在设置后的数小时内即可生长为大型棱柱状晶体。

我们刚刚向您展示了进行该实验操作时如何设置蛋白质实验。在温度和湿度稳定受控的环境中操作非常重要，因为较高的湿度有助于减少液滴蒸发；应尽量采用能够减少液滴暴露于空气中的技术。因此，必须在井然有序的工作环境中进行操作。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。