Name: X射线晶体学的蛋白质结晶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-16T16:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学习蛋白质结晶技术用于X射线衍射实验，包括悬滴法、坐滴法蒸汽扩散结晶和微批次结晶方法。这些技术帮助研究人员获得高质量蛋白质晶体以解析大分子三维结构。

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本工作获得了授予YM的伯纳姆惠康研究员奖以及授予MD的耶鲁大学布朗-考克斯博士后奖学金的支持。

材料：
<ul>
<li>蛋白样品 - 溶菌酶（50 mg/mL）</li>
<li>悬滴法24孔板</li>
<li>坐滴法24孔板</li>
<li>微批量结晶96孔板</li>
<li>结晶溶液（ commercially available 或自制）</li>
<li>硅脂</li>
<li>5 mL 注射器（无鲁尔锁）</li>
<li>硅化盖玻片</li>
<li>光学密封膜</li>
<li>石蜡</li>
<li>0.1–2 μL 微量移液器（低吸附枪头）</li>
<li>镊子</li>
<li>专业擦拭纸</li>
</ul>
1. 悬滴/坐滴法操作步骤：
<ol>
<li>初步筛选时，可使用市售的试剂盒，这些试剂盒采用稀疏矩阵不完全因子法来设置试验条件。该稀疏矩阵不完全因子法基于已知的大分子结晶条件进行设计和选择（Carter 和 Carter，1979；Cudney et al.，1994；Jancarik 和 Kim，1991；Jancarik et al.，1991）。如果已知结晶条件，可构建一个范围较窄的筛选体系，在初始有效条件附近调整沉淀剂浓度和 pH 值。最常用的沉淀剂是聚乙二醇（PEG），其次是硫酸铵。这两种沉淀剂合计占所有记录在案的大分子结晶沉淀剂使用情况的约 60%（Gilliland et al.，1994；Kimber et al.，2003；Page et al.，2003）。</li>
<li>配制你的结晶溶液。通常这些条件由一种沉淀剂、某种盐类以及用于调节 pH 的缓冲液组成。在某些情况下，可针对目标蛋白添加特定的添加剂。所有储备液均应使用 0.22 μm 滤膜过滤。部分储备液可能非常黏稠（如 50% PEG、甘油、PEG-MME 等）。
<ul>
<li>分别用 0.1 M NaOAc（pH 4.0、4.3、4.6 和 4.9）配制 1.5 mL 的 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 M NaCl 溶液（共 24 种溶液）</li>
</ul></li>
<li>将蛋白样品解冻并置于冰上保存。蛋白储备液应保存在 -80°C，除非目标蛋白对冻融循环敏感（若如此，则保存于 4°C）。典型蛋白浓度范围为 5–50 mg/mL，通常较高浓度会获得更好的结果。</li>
<li>以 15 分钟、18,000×g、4°C 离心样品——某些蛋白在解冻后容易发生部分聚集和沉淀。这些聚集体可能促进其余蛋白分子的无定形沉淀，因此充分离心可确保样品中仅含有可溶性分子。在设置实验板之前，始终将蛋白保持在冰上。</li>
<li>使用紫外分光光度计在 280 nm 处测定蛋白样品的吸光度以确定其浓度。蛋白浓度可通过吸光度读数及其消光系数计算得出。消光系数可通过 ExPASy 网站上的 ProtParam 工具计算：<a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a></li>
<li>根据实验板设置方案（图 2B），向 24 孔悬滴/坐滴板的各孔中加入 500 μL 沉淀剂溶液。在孔边缘涂布一圈硅脂环，环上应留有小缝隙，以防止密封时孔内气压积聚。在坐滴法中无需使用硅脂，因为孔是用透明胶带密封的（图 2A）。</li>
<li>取一块盖玻片，用压缩空气喷雾或专业擦拭纸清洁，避免灰尘污染，这有助于清晰观察结晶液滴并防止污染。坐滴法中不使用盖玻片，而是利用孔内的平台来混合蛋白溶液与沉淀剂溶液。</li>
<li>在盖玻片上等体积加入蛋白样品和储液。在优化过程中可尝试不同的蛋白与沉淀剂体积比例。当蛋白体积大于沉淀剂时，平衡后液滴中的蛋白将发生净浓缩，这对于稀释的蛋白样品、减缓晶体成核或生长速度可能是有利的。液滴中任何其他非挥发性物质也将按相同比例浓缩。将蛋白和储液加到盖玻片上时，务必小心避免产生气泡，这通常发生在移液器吹出空气时。
<ul>
<li>悬滴法：在盖玻片中央加入 2 μL 浓度为 50 mg/mL 的溶菌酶溶液（0.02 M NaOAc，pH 4.9），再加入 2 μL 储液。</li>
<li>坐滴法：在平台中央加入 2 μL 浓度为 50 mg/mL 的溶菌酶溶液，再加入 2 μL 储液。</li>
</ul></li>
<li>轻柔地将盖玻片翻转，并将其放置在孔上方的硅脂环上。轻轻按压，使空气可通过硅脂环上的缺口排出，防止孔内气压积聚，保持孔的密封状态。孔内气压积聚可能导致盖玻片隆起，破坏密封。在坐滴法中，使用光学透明的胶带覆盖各孔，因此该方法中每行/列需单独密封。</li>
<li>依次处理下一个孔，直至完成整块实验板。</li>
<li>设置完成后立即检查实验板——清除灰尘颗粒和其他污染物可减少蛋白晶体的假阳性识别。</li>
<li>使用评分表记录实验过程。</li>
<li>将实验板置于所需的孵育温度下，通常在 4°C 至室温之间。20°C 是最常获得成功的温度。操作时需轻柔，避免任何震动。开关培养箱门时也应小心。在转移或孵育过程中产生的振动或温度变化可能抑制晶体生长或降低晶体质量。可在晶体板下方垫上减震材料（如包装泡沫）以减少震动影响。</li>
<li>次日开始检查实验板是否有晶体形成，之后每隔数天检查一次，始终小心操作。在专用的评分表中记录所有观察结果及液滴形态。晶体通常在 2–5 天内出现，尽管有时会更快（几乎立即出现）或更晚（长达数月）。一旦确定了结晶条件并了解了晶体生长速率，最好在晶体出现并生长至最终尺寸的一半之前不要扰动实验板。保持实验板静止可减少晶体成核事件，从而产生数量较少但尺寸更大的晶体。</li>
</ol>
2. 微量批量法操作步骤：
<ol>
<li>蛋白质样品和沉淀剂的准备步骤如上所述。</li>
<li>使用气雾喷枪清洁新的微批量筛选板，以避免灰尘及其他大颗粒污染物。</li>
<li>在微批量筛选板中加入石蜡油，高度至3 mm（足以覆盖所有孔位），然后去除多余的油。</li>
<li>将1 μL蛋白质溶液（50 mg/mL 溶菌酶）加入预先加有油的孔中——确保用移液器将溶液直接注入孔底（图2A）。</li>
<li>根据板布局方案，向孔中加入1 μL沉淀剂溶液（图2B）——确保液滴沉至孔底并与蛋白质液滴融合。</li>
<li>继续操作至下一个孔，直至完成整块板。</li>
<li>执行悬滴/坐滴法操作步骤11–14。</li>
</ol>

<ol><li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+TM+%22Protein+crystallization+%3A+techniques%2C+strategies%2C+and+tips+%3A+a+laboratory+manual%22">Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual</a>. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).</li>
<li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li>
<li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li>
<li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+%28CSN7%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li>
<li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Macromolecule+Crystallization+Database%2C+Version+3.0%3A+new+features%2C+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li>
<li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparse+matrix+sampling%3A+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Cryst%22%5BJournal%5D)">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li>
<li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li>
<li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+mining+crystallization+databases%3A+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li>
<li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+growth+of+proteins%2C+nucleic+acids%2C+and+viruses+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcPherson%2C+A+%22Crystallization+of+biological+macromolecules%22">Crystallization of biological macromolecules</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li>
<li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics%3A+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文中，我们描述并演示了蛋白质结晶的一般现行实验方案。由于该过程包含多个步骤，因此有一些注意事项需要特别关注。在处理极小体积（0.5–2 μL）液体时，液滴因蒸发而干燥是一个主要问题。因此，建议在环境条件严格控制的环境中操作（低气流、高湿度、温度稳定），并采用尽量减少液滴暴露于空气中的技术。基于这一原因，在井然有序的工作环境中操作至关重要。所有试剂应在设置实验板之前预先准备好，实验设备应触手可及（移液器、枪头、离心管、擦拭纸等）。
通常情况下，应在准备设置实验板前尽可能短的时间内将蛋白质从储存环境中取出。这样可以尽量减少环境因素对样品的影响。操作时必须握住蛋白管的管颈部分，而不是管底含有蛋白质的区域，以避免手温导致样品受热。采取上述预防措施，可最大限度地减小实验误差，从而提高实验结果的可重复性。
此处描述的实验方案有许多可能的修改方式。可以调整蛋白质浓度、蛋白质与沉淀剂的比例、温度（4°C - 37°C）、pH值，并可添加各种添加剂。另一种相对常用的蛋白质结晶方法是透析法。在此方法中，蛋白质溶液通过半透膜对沉淀剂溶液进行透析。...

<table><tbody><tr><td>溶菌酶</td><td></td><td>Sigma-aldrich</td><td>L6876-1G</td></tr><tr><td>24孔VDX板</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-142</td></tr><tr><td>24孔Cryschem板</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td></tr><tr><td>道康宁真空润滑脂</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-510</td></tr><tr><td>硅化玻璃圆形盖玻片</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td></tr><tr><td>100% 石蜡油</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-411</td></tr><tr><td>1.88英寸宽Crystal Clear封板膜</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-511</td></tr><tr><td>96孔Imp@ct板（微批量板）</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-098</td></tr></tbody></table>

用于x射线晶体学的蛋白质结晶

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

利用生物大分子的三维结构推断其功能是现代生物学最重要的研究领域之一。原子分辨率结构的获得为理解蛋白质功能提供了深刻而独特的视角，并有助于揭示活细胞内部的运作机制。迄今为止，蛋白质数据库（rcsb-PDB）中86%的条目是通过X射线晶体学方法测定的大分子结构。
为了获得适合晶体学研究的晶体，大分子（例如蛋白质、核酸、蛋白质-蛋白质复合物或蛋白质-核酸复合物）必须被纯化至均一，或尽可能接近均一。样品的均一性是获得高分辨率衍射晶体的关键因素（Bergfors, 1999；McPherson, 1999）。
结晶需要使大分子达到过饱和状态。因此，应将样品浓缩至尽可能高的浓度，同时避免引起大分子的聚集或沉淀（通常为 2–50 mg/mL）。将样品引入沉淀剂可促进溶液中蛋白质晶体的成核，从而可能从溶液中生长出大的三维晶体。获得晶体主要有两种技术：蒸气扩散法和批量结晶法。在蒸气扩散法中，含有沉淀剂与蛋白质溶液混合液的液滴被密封在一个含有纯沉淀剂的腔室内。水蒸气随后从液滴中扩散出来，直到液滴与沉淀剂的渗透压相等（图 1A）。液滴脱水导致蛋白质和沉淀剂缓慢浓缩，直至达到相图中理想的晶体成核区。批量法则是通过将蛋白质与适量的沉淀剂混合，直接使蛋白质进入成核区（图 1B）。该方法通常在石蜡油/矿物油混合物下进行，以防止液滴中的水扩散出去。
本文将演示两种用于蒸汽扩散法的实验装置，即悬滴法和坐滴法，此外还包括油下批量结晶法。

结晶通常被认为是X射线晶体学的瓶颈。通过采用沉淀条件的稀疏矩阵不完全因子筛选，通常会产生多种不同类型的蛋白质聚集和沉淀现象，其中包括大尺寸的单晶。如果蛋白质或沉淀剂的浓度过高，则会观察到无固定形状和大小的棕色物质（非晶态沉淀）。当溶液处于不饱和状态时，液滴通常完全透明，且不出现任何形式的沉淀。图3展示了多种沉淀现象与晶体的示例（Dessau et al., 2006）。更多沉淀现象及其详细解读可参见 <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a>。
	<img fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1highres.jpg" alt="蛋白质结晶相图；成核、沉淀及实验装置...

分子的三维结构能够提供其功能机制的独特理解。在接近原子分辨率下测定结构的主要方法是X射线晶体学。本文中，我们将演示当前获得适用于X射线晶体学结构解析的任意大分子三维晶体的方法。

用于X射线晶体学的蛋白质结晶

利用生物大分子的三维结构推断其功能是现代生物学最重要的研究领域之一。

本实验的总体目标是制备用于X射线衍射实验的蛋白质晶体。本文展示了三种不同的晶体筛选技术，包括悬滴法和坐滴法的蒸气扩散结晶方法，以及微批量结晶方法。在蒸气扩散结晶中，将沉淀剂加入到孔中。然后将高浓度的纯化蛋白质样品与沉淀剂混合。将混合后的液滴密封在含有沉淀剂溶液的孔中。微批量结晶开始于用石蜡油填充孔板。 然后将蛋白质加入到孔中，接着加入沉淀剂溶液。所有方法的最后一步是让体系达到平衡，并观察液滴中晶体的出现和生长情况。最终，可通过该技术获得晶体，并利用配备合适探测器的X射线源测定蛋白质的衍射图谱。大家好，我是来自耶鲁大学分子生物物理学与生物化学系Yoga Motis教授实验室的Sal。今天我们将向您展示一种纯化蛋白质的结晶方法。我们实验室利用该方法研究病毒感染的结构基础。那么，让我们开始培养一些晶体。为了确定目标大分子的结晶方法，可使用市售的结晶溶液进行初步筛选，这些溶液的选择基于稀疏矩阵不完全因子法来设计试验条件。这些条件是根据已知且通常成功的大分子结晶条件而选定的。一旦确定了结晶条件，便可围绕初始的阳性结果，在沉淀剂浓度和pH值附近设计一个窄幅筛选实验。通常，此类筛选所用的结晶条件包含一种沉淀剂和一种用于设定pH值的缓冲液；所有储备溶液在此演示中均须通过0.22微米滤膜过滤。本实验采用先前确定的鸡溶菌酶结晶条件，以氯化钠作为沉淀剂；首先配制1毫升不同浓度的氯化钠溶液，溶于0.1摩尔的醋酸钠缓冲液中，并调节至不同的pH值。接下来，将保存在-80摄氏度的蛋白样品解冻，并置于冰上保持低温。典型的蛋白浓度范围为每毫升5至50毫克，较高浓度通常可获得更好的结果。此处使用的是每毫升50毫克的溶菌酶溶液（来自鸡卵清），溶剂为0.02摩尔/升、pH 4.9的醋酸钠缓冲液。在 18,000 G 和 4 °C 条件下离心样品 15 分钟，以去除解冻步骤中可能产生的部分聚集蛋白或沉淀物。这些聚集体可能干扰晶体生长并促进进一步聚集。离心结束后。使用紫外光谱光度计，根据蛋白质在280纳米处的吸光度测定其浓度。蛋白质浓度可通过吸光度读数及该蛋白质的消光系数计算得出。待蛋白质样品制备完成后，按照晶板图谱，在24孔悬滴结晶板的每个孔中加入500微升沉淀剂溶液。在每个孔的边缘涂抹一圈硅脂，但不要完全闭合该环，以便在盖上盖玻片时空气能够逸出。使用压缩空气喷雾或专业擦拭纸清洁盖玻片，以避免灰尘污染，这有助于更好地观察结晶液滴并消除杂质。下一步是用移液器将等体积的蛋白质样品和储液溶液转移到盖玻片上。然而，在优化过程中，可以尝试不同体积的蛋白质和沉淀剂；使用比沉淀剂更多的蛋白质会导致平衡后液滴中的蛋白质净浓度升高，这可能有利于稀释的蛋白质样品，或用于减缓晶体成核或生长速度。本演示中，在盖玻片中心加入两微升浓度为50毫克/毫升、溶于0.02摩尔醋酸钠（pH 4）的溶菌酶，随后加入两微升结晶溶液。将蛋白

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