稳定同位素示踪分析在发育期与成年期中间代谢流中的应用 秀丽隐杆线虫

以下实验的总体目标是在整体动物水平上，无创地实时监测由特定代谢通路、遗传改变和/或药物处理引起的糖酵解、丙酮酸代谢以及三羧酸循环中的代谢变化。该目标通过向活体线虫喂食稳定同位素，使多种代谢物获得足够的同位素富集，从而实现对中间代谢通路中遗传和/或药物诱导改变的定量分析。第二步，通过气体比率质谱法检测大气和溶解性二氧化碳中的同位素掺入情况，从而在较短时间内更直接地评估中间代谢通量。

接下来对样品进行全虫游离氨基酸的HPLC分析，以及通过GCMS对氨基酸和有机酸进行同位素富集分析，以定量测定线虫中代谢通量的变化。在给予稳定同位素暴露后，获得结果显示了不同同位素暴露时长、细菌清除以及野生型线虫替代裂解方法对中间代谢物中同位素丰度的影响。该方法可为探究中间代谢提供见解。

该方法也可应用于我们的系统，如哺乳动物细胞系和组织。我们最初产生这一方法的想法，是在通过高效液相色谱法（HPLC）分析游离线虫氨基酸时，观察到持续存在的异常现象，这些异常提示在初级呼吸功能改变的情况下，中间代谢流可能受到损害。接下来开始本实验操作。

在发育期或成虫期暴露于稳定同位素标记的代谢前体的线虫，收集至1.5毫升塑料离心管中。通常将线虫稀释至每1毫升含1000条线虫的浓度。向线虫中加入含ε-氨基己酸作为内标的60%高氯酸，使高氯酸终浓度为4%，内标终浓度为20纳摩尔。

让线虫在重力作用下静置沉降5分钟，然后移除上清液并保存至另一离心管中。以下步骤是本实验流程中最关键的环节之一。在进行游离代谢物分析之前，必须通过筛分彻底破坏线虫样品。使用塑料匀浆器和电动钻机，将线虫样品研磨15秒。

通过光学显微镜观察确认线虫是否已被充分破碎，必要时重复研磨步骤。本图中，A 和 B 图显示研磨前的线虫；相比之下，C 和 D 图显示研磨后的线虫。将先前保存的上清液转移至含有线虫匀浆物的 1.5 毫升塑料离心管中，随后进行离心。

将样品在2,250 RPM（1300 ×g）条件下离心五分钟。离心后，将上清液转移至一支新的7毫升玻璃试管中。将沉淀物保留，用于后续的蛋白质浓度测定。

然后向 SUPERNAT 中加入四当量氢氧化钾，调节样品 pH 至 7 到 8，随后离心。将中和后的样品置于 7 毫升玻璃管中，以 2,250 转/分钟（1,300 ×g）离心 5 分钟。为去除盐分，将每份样品的上清液转移至新的 7 毫升玻璃管中。中和后的样品现可进行代谢物定量分析，可采用高效液相色谱法（HPLC）或气相色谱-质谱联用法（GC-MS）进行 HPLC 分析。

将每份中和后的样品分别取出 50 微升，用于直接进样至高效液相色谱仪。游离氨基酸的定量采用预先柱前衍生化方法，使用邻苯二甲醛和荧光检测。如前所述，剩余的中和样品将使用离子交换树脂进行提取，用于气相色谱-质谱联用分析，以测定氨基酸和有机酸中的同位素富集度，如下一节所示。

为制备珠粒，分别向 G1 和 G50 珠粒中加入一当量盐酸。在 1 升烧杯中，用磁力搅拌器分别搅拌每瓶溶液 30 分钟。随后，用去离子水洗涤珠粒 10 次，直至洗涤液的 pH 值与水的 pH 值相同为止。

接下来，我们将展示如何使用玻璃移液管自制低成本的层析柱。预装柱也可从商业途径获得。制备层析柱时，用镊子将一小团棉花置于巴斯德移液管尖端最狭窄处的上方，用于有机酸提取的G-1珠和G-50珠。

进行氨基酸提取时，将每根层析柱填充至柱高约三分之一处。如果样品的pH值已为中性，则在上样至AG 1型层析柱前无需向样品中添加任何物质。为了提取有机酸以进行氨基酸提取，在将样品上样至AG 50型层析柱前，需向样品中加入1毫升0.1当量的盐酸。

现在将先前制备的中和样品分别加入各柱中。用去离子水洗涤每个柱子10次，直至洗出液呈中性。洗涤完成后，将各柱用新鲜的、已标记的4毫升玻璃样品小瓶进行洗脱。对于有机酸的提取，向AG 1型柱中加入3毫升3当量的盐酸。

这允许分析三碳物种、四碳物种、五碳物种和六碳物种中标记碳原子总数的同位素富集情况。进行氨基酸提取时，在AG 50柱中加入三毫升4 N氢氧化铵。这允许分析三碳物种和五碳物种中标记碳原子总数的同位素富集情况。

完成有机酸和氨基酸提取后，将样品管置于三通道旋转蒸发仪中过夜，直至完全干燥。随后，样品经衍生化处理，并按照方案文本中的详细步骤进行气相色谱-质谱（GCMS）分析。本实验步骤开始时，将一千条年轻成虫期线虫转移至含有碳13全标记葡萄糖和大肠杆菌的实验用35毫米NGM琼脂平板中。

接下来，将未加盖的实验用NGM平板放入一个定制的玻璃室中，该玻璃室配备了一个密封良好的三通旋塞阀，以便精确取样和更换气体环境。在光学透明玻璃圆盘与平板接触的密封处涂抹高真空润滑脂。

用玻璃圆盘密封反应室。记录时间。以此时为零点，30分钟后，使用20毫升注射器通过三通旋塞从玻璃室中抽取10毫升气体样品。

关闭通向腔室的旋塞。取样后，将样品转移至含有1毫升0.1摩尔氢氧化钠中碳酸氢钠的红色真空玻璃管中。接下来，通过三通旋塞向玻璃腔室内注入10毫升空气。使用20毫升注射器，在重新注入空气并继续孵育之前，于60、90和120分钟时重复从玻璃腔室中采集空气样品。

按照方案文本所述，使用气体同位素比质谱仪分析这些大气二氧化碳样品中的标记碳富集情况。稳定同位素在喂食活体或经紫外照射灭活的OP50大肠杆菌的线虫中，两小时后即可有效掺入幼年成虫体内，这一点可通过大气二氧化碳及线虫体内溶解性二氧化碳中检测到的标记碳得到证实。与释放到大气中的二氧化碳相比，线虫体内溶解性二氧化碳组分中的¹³CO₂/¹²CO₂比值更高。观察发现，若从幼虫期开始长期暴露于稳定同位素，随后将线虫转移至不含细菌的NGM平板上清除体内细菌，可进一步提高幼年成虫体内游离谷氨酸的同位素富集水平。

在此图中，L1 代表从 L1 幼虫阶段到 959 细胞的年轻成虫阶段持续喂食完全标记的碳 13 葡萄糖和 OP50 细菌的线虫，YA 代表在达到产卵第一天的年轻成虫阶段后，开始喂食碳 13 葡萄糖和 OP50 细菌 48 小时的线虫。x 轴表示每种谷氨酸分子中标记的碳原子总数，y 轴表示富集百分比。所有动物在进行下游样品制备前均已清除多余的同位素标记。

进行GCMS分析时，绿色柱状图表示在PCA提取前两小时，在NGM平板上喂食OP50大肠杆菌以进行同位素暴露后清除体内菌的线虫。蓝色和灰色柱状图分别表示在PCA提取前两小时或六小时，在不含细菌的NGM平板上进行同位素暴露后清除体内菌的线虫，无论同位素暴露的时间进程如何。当动物在平板上清除两小时或六小时时，中间代谢物中的同位素富集程度未观察到显著差异。

在两种同位素暴露条件下，当动物通过喂食未标记的细菌清除2小时后，中间代谢物中的同位素富集程度均较低。因此，对于在含有同位素的细菌涂布NGM平板上培养的线虫，确定最佳的清除方案为：在未涂布细菌的NGM平板上清除2小时，以优化中间代谢物中的同位素富集百分比。随后，在液体培养基中处理24小时，培养基中含有一个六碳¹³C标记的葡萄糖，且不添加细菌。

如图所示，比较了仅通过超声处理或超声结合研磨方式破碎的线虫样品。与仅通过超声处理的样品相比，采用超声结合研磨方法破碎的线虫表现出更高的同位素富集水平。实验最终通过在平板上从L1阶段开始，或在液体培养中从产卵第一天起作为年轻成虫持续24小时喂食活线虫稳定的同位素前体，实现同位素标记。该方法可对代谢物中的同位素富集进行高灵敏度分析，从而反映糖酵解、丙酮酸代谢及三羧酸循环中的代谢通量情况。

该技术为线粒体疾病的研究开辟了道路，使科研人员能够探索海鞘中的中间代谢流。观看本视频后，您应能充分理解如何在秀丽线虫中进行稳定同位素标记，以及中间代谢和代谢流的分析。