Name: 在开发和成年阶段的中介代谢通量的稳定同位素分析线虫 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 学习利用稳定同位素示踪技术分析秀丽隐杆线虫发育期和成年期的中间代谢通量变化。该方法结合气体质谱和色谱技术，可实时监测糖酵解、丙酮酸代谢及三羧酸循环的动态改变。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（K08-DK073545 及由 NICHD 资助的智力与发育障碍研究中心新研究者奖）、费城基金会和宾夕法尼亚大学 McCabe 奖（M.J.F.）以及 Tristan Mullen 基金（M.J.F. 和 M.Y.）资助。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

<ol><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%3A+A+practical+approach%22">C. elegans: A practical approach</a>. , University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li>
<li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chromatography%22%5BJournal%5D)">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li>
<li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li>
<li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).</li>
<li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

采用质谱法测定中间代谢物中的同位素丰度，能够极为详细地揭示关键的生化变化5。本文提供了详细的实验方案，用于利用这一高灵敏度和高特异性的方法，在遗传操作灵活的模式动物 C. elegans 中评估中间代谢通量。事实上，通过向活体动物喂食稳定同位素标记的代谢前体（如 13C-葡萄糖），并在下游代谢物中测定同位素富集程度，可获得关于中间代谢途径通量的全新见解。我们已建立可靠的方法，用于对糖酵解、丙酮酸代谢以及三羧酸循环中的代谢通量进行稳健分析。该方法既可用于从早期幼虫发育阶段开始喂食稳定同位素的动物，也可用于从有丝分裂后成虫期开始喂食的动物。不同代谢物种类的同位素富集情况可与全虫游离氨基酸的高效液相色谱分析相结合（如前所述4），以确定虫体中游离丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺各组分的绝对同位素富集度。在1,000至2,000条同步化的年轻成虫期线虫样品中测定氨基酸和有机酸分析物时，可获得一致的同位素富集模式。该方法能够灵敏地区分核基因相关的线粒体突变株与野生型线虫之间中间代谢通量的异常差异。
该技术可用于研究与常见先天性代谢缺陷相关的特定生化通路中的流量变化。特别是，使用稳定同位素标记的葡萄糖可揭示与线粒体疾病相关的核心代谢通路中的碳流情况。事实上，我们的数据表明，该方法能够灵敏地区分核基因介导的线粒体复合体III亚基突变株（isp-1(qm150)）与野生型线虫之间在中间代谢流量上的异常差异。
需要注意的是，由于同位素暴露过程持续数天，所测定的同位素富集程度反映的是“稳态”富集值，而非在细胞模型中通过数分钟至数小时同位素暴露所测定的特定时间段内的可量化通量。在研究线虫发育过程中代谢通路通量时，另一个潜在的局限性在于特定突变株中幼虫发育时间存在差异。例如，已知许多严重的线粒体突变会导致线虫停滞在第三（L3）幼虫阶段6。因此，仅对存活至成虫阶段的个体进行同位素掺入分析，可能无法代表整个突变群体。然而，该方法可进行调整，以评估特定幼虫阶段（如L2阶段）中间代谢物的同位素掺入情况，而不必等待动物发育至成虫阶段。类似地，进入称为dauer的替代性幼虫阶段的个体，其代谢通量很可能显著改变（可能降低），与直接经历四个幼虫阶段的个体相比存在明显差异。未来的研究还可直接评估不同遗传背景下dauer阶段个体的同位素掺入情况。在动物达到年轻成虫阶段后（如方案B所述），开始进行固定时间（此处为24至48小时）的稳定同位素暴露，可消除发育周期差异带来的影响。虽然13C-葡萄糖仅能用于研究糖酵解、丙酮酸代谢和三羧酸循环的通量，但也可评估其他同位素示踪剂，以探究线虫中其他感兴趣生化通路的通路通量。例如，可利用15N-甘氨酸来评估线虫中氨基酸的周转情况。
该方法的另一个潜在局限性在于代谢物检测的灵敏度水平。根据我们的经验，使用本文所采用的高效液相色谱（HPLC）和气相色谱-质谱联用（GC/MS）方法，至少需要500条年轻成虫期线虫，才能成功定量同位素掺入情况。使用灵敏度更高的仪器，例如超高效液相色谱（UPLC），可能进一步减少所需研究的动物数量，但我们预计这仍难以实现对单条线虫中代谢物及其同位素掺入种类的可靠定量。在本研究中，每次实验使用了1,000条线虫的群体规模，该数量可稳定检测每种品系中低丰度代谢物。然而，某些代谢物（如γ-氨基丁酸，GABA）仅能在更大规模的线虫群体中实现可靠定量，其数量级约为1×106条动物4。
总之，稳定同位素分析提供了一种非侵入性且安全（非放射性）的方法，长期以来被用于研究先天性代谢缺陷。将该方法应用于C. elegans，可实现对整个生物体水平上发生的体内实时代谢变化进行新颖的探究，这些变化可能由单个遗传病和/或药物暴露引起。

<table><tbody><tr><td>S. basal</td><td></td><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; 第59页</td><td>方案A和方案B</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8503</td><td>方案B</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心</td><td></td><td>方案A和方案C</td></tr><tr><td>K12 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心</td><td></td><td>方案B</td></tr><tr><td>NGM 琼脂</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000.0</td><td>方案A、B和C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C葡萄糖（全标记）</td><td>剑桥同位素实验室</td><td>CLM-1396</td><td>方案A和C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C葡萄糖（1,6标记）</td><td>剑桥同位素实验室</td><td>CLM-2717</td><td>方案B</td></tr><tr><td>60% 高氯酸 (PCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MK2766500</td><td>方案A和方案B</td></tr><tr><td>&amp;#949;-氨基己酸（内标）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2504</td><td>方案A和方案B</td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>雷吉斯</td><td>270243</td><td>实验方案 E</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>雷吉斯</td><td>270010</td><td>实验方案 E</td></tr><tr><td>AG 1-X8，100-200，氯离子型树脂</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>140-1441</td><td>方案A和方案B（有机酸提取）</td></tr><tr><td>AG 50W-X8，100-200，氢型树脂</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>142-1441</td><td>方案A和方案B（氨基酸提取）</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8875</td><td>方案 C</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>方案 C</td></tr><tr><td>3N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>方案 D</td></tr><tr><td>1N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>方案A</td></tr><tr><td>0.1 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>方案 D</td></tr><tr><td>4N NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501</td><td>方案 D</td></tr><tr><td>4N KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>方案A和B</td></tr><tr><td>去离子水</td><td>Milli Q Biocel</td><td>ZMQA60F01</td><td>方案 D</td></tr><tr><td>氦</td><td>Airgas</td><td>24001364</td><td>方案 C2</td></tr><tr><td>SMZ-800 变焦体视显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>NI MNA41000</td><td>方案A、B和C</td></tr><tr><td>pH计</td><td>Fisher Scientific</td><td>S68167</td><td>方案A和方案B</td></tr><tr><td>台式离心机 - 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-93</td><td>方案A和方案B</td></tr><tr><td>孵育平台摇床</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>M1324-0004</td><td>方案B</td></tr><tr><td>Mini LabRoller 旋转混匀仪</td><td>Labnet International</td><td>H-5500</td><td>方案A和方案B</td></tr><tr><td>研钵杵</td><td>Kontes Corp</td><td>K749520-0090</td><td>方案A和方案B</td></tr><tr><td>钻孔</td><td>Kontes Corp</td><td>K749540-0000</td><td>方案A和方案B</td></tr><tr><td>1 L 玻璃烧杯</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-539P</td><td></td></tr><tr><td>1 L 锥形瓶</td><td>VWR 国际公司</td><td>89000-368</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 锥形瓶</td><td>VWR 国际公司</td><td>89000-356</td><td>方案B</td></tr><tr><td>7 ml 圆底玻璃管 + 橡胶塞</td><td>VWR 国际</td><td>VT6431</td><td>方案A、B和C1、C2</td></tr><tr><td>10 ml 圆底玻璃管 + 橡胶塞</td><td>VWR 国际公司</td><td>VT6430</td><td>方案 C2</td></tr><tr><td>蓝顶管</td><td>Labco</td><td>438B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形塑料离心管</td><td>Falcon BD</td><td>14-959-49A</td><td>所有实验方案</td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td>方案A和B</td></tr><tr><td>注射器（1 mL，10 mL，20 mL）</td><td>BD 生物科学</td><td>301025, 301029, 301031</td><td>方案C1和C2</td></tr><tr><td>25号针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-253-131</td><td>方案C1和C2</td></tr><tr><td>Poly-Prep 色谱柱</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>731-1550</td><td>方案 D</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>VWR 国际公司</td><td>14673-043</td><td>方案 D</td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>VWR 国际公司</td><td>25373-085</td><td>方案 C</td></tr><tr><td>带油脂密封三通旋塞的玻璃室（由1 L烧瓶底部切割制成）</td><td>定制</td><td></td><td>方案C</td></tr><tr><td>光学透明玻璃板</td><td>定制</td><td></td><td>方案 C</td></tr><tr><td>Reacti-Vap III 浓缩仪</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>18826</td><td>方案 D</td></tr><tr><td>棉絮</td><td>VWR 国际公司</td><td>14224-516</td><td>方案 D</td></tr><tr><td>高真空润滑脂</td><td>道康宁</td><td>1597418</td><td>方案 C1</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-18</td><td>方案B</td></tr><tr><td>计时器</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-2504-5</td><td>方案 C</td></tr><tr><td>气体比率质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td></td><td>方案 D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Hewlett-Packard</td><td>5980/5971</td><td>方案 D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>安捷伦科技</td><td>6980N/5973N</td><td>方案 D</td></tr><tr><td>高效液相色谱法</td><td>Varian 公司，Agilent</td><td>9010</td><td>方案 D</td></tr></tbody></table>

稳定同位素示踪分析在发育期与成年期中间代谢流中的应用 秀丽隐杆线虫

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

稳定同位素示踪技术长期以来被用于灵敏地研究基因突变和/或药物治疗在细胞及哺乳动物模型中的代谢效应。本文详细描述了在线虫Caenorhabditis elegans中进行中间代谢和代谢通量稳定同位素示踪分析的具体方法。所述方法可用于分析整个线虫体内的游离氨基酸、标记的二氧化碳、标记的有机酸以及标记的氨基酸，这些线虫在从早期发育阶段起即暴露于含有稳定同位素的线虫生长培养基琼脂平板上，或在液体培养中从年轻成虫阶段开始接受不同药物处理。通过高效液相色谱法（HPLC）对用4%高氯酸提取的全虫样品中的游离氨基酸进行定量分析。采用全标记的13C-葡萄糖或1,6-13C2-葡萄糖作为稳定同位素前体，利用质谱法追踪其标记碳在二氧化碳（包括气态和溶解态）以及在糖酵解、丙酮酸代谢和三羧酸循环通量相关代谢物中的分布情况。文中提供了代表性结果，以展示同位素暴露时间、不同细菌清除方案以及野生型线虫中不同线虫破碎方法的影响，同时比较了线粒体复合体III突变线虫（isp-1(qm150)）与野生型线虫之间同位素掺入程度的差异。在活体线虫中应用稳定同位素示踪分析，为在整体动物水平上实时研究由单个遗传疾病和/或药物治疗引起的代谢改变提供了新的手段。

本文描述了通过气相色谱-质谱联用技术对线虫Caenorhabditis elegans的中间代谢流进行稳定同位素示踪分析的方法。详细介绍了在琼脂平板上发育阶段或液体培养中成虫阶段暴露于同位素后，测定二氧化碳、有机酸和氨基酸中同位素富集度的技术流程。

稳定同位素示踪分析长期以来允许对基因突变和/或药物治疗的代谢效应进行高灵敏度的研究……

以下实验的总体目标是在个体代谢通路、基因改变和/或药物处理引起的情况下，无创地在整体动物水平上实时监测糖酵解、丙酮酸代谢以及三羧酸循环中的代谢变化。该目标通过向活体线虫喂食稳定同位素，使多种代谢物获得足够的同位素富集，从而实现对中间代谢通路中基因和/或药物干预所导致变化的定量分析。第二步，通过气体比率质谱法检测大气和溶解性二氧化碳中的同位素掺入情况，从而在较短时间内更直接地评估中间代谢通量。接下来，利用高效液相色谱法（HPLC）对样品进行全虫游离氨基酸分析，同时采用气相色谱-质谱联用法（GCMS）检测氨基酸和有机酸的同位素富集情况，以定量分析线虫中代谢通量的变化。在给予稳定同位素暴露后，获得的结果展示了不同同位素暴露时间、细菌清除以及野生型线虫不同裂解方法对中间代谢物中同位素丰度的影响。该方法可为探究中间代谢的动态变化提供重要见解。该方法也可应用于我们的系统，如哺乳动物细胞系和组织。我们最初产生这一方法的想法，源于在使用高效液相色谱法（HPLC）分析游离线虫氨基酸时，观察到持续存在的异常现象，这些异常提示在初级呼吸功能改变的情况下，中间代谢流可能受到损害。接下来开始本实验操作。在发育期或成虫期暴露于稳定同位素标记的代谢前体的线虫，收集至1.5毫升塑料离心管中。通常将线虫稀释至每1毫升含1000条线虫的浓度。向线虫中加入含ε-氨基己酸（作为内标）的60%高氯酸，使终浓度为4%高氯酸和20纳摩尔内标。让虫体在重力作用下静置5分钟，然后移除并保存上清液至另一管中。以下步骤是本实验流程中最关键的环节之一。在进行游离代谢物分析之前，必须通过筛分彻底破坏虫体。使用塑料匀浆器和电动钻，将虫体样本研磨15秒。通过光学显微镜观察确认线虫是否已被充分破碎，如有必要，可重复研磨步骤。本图中，A 和 B 图显示的是研磨前的线虫；相比之下，C 和 D 图显示的是研磨后的线虫。将之前保存的上清液转移至含有线虫匀浆物的 1.5 毫升塑料离心管中，随后进行离心。将样品在2,250 RPM（1300 G）下离心五分钟。离心后，将上清液转移至一个新的7毫升玻璃管中。将沉淀物保存起来，用于后续的蛋白质浓度测定。然后向 SUPERNAT 中加入四种正常浓度的氢氧化钾，调节样品 pH 值至 7 到 8，随后离心。将中和后的样品置于 7 毫升玻璃管中，以 2,250 转/分钟（1,300 ×g）离心 5 分钟。为去除盐分，将每份样品的上清液转移至新的 7 毫升玻璃管中。中和后的样品现可进行代谢物定量分析，采用高效液相色谱法（HPLC）或气相色谱-质谱联用法（GCMS）进行 HPLC 分析。将每份中和后的样品分别取出 50 微升，用于直接进样至高效液相色谱（HPLC）。游离氨基酸的定量采用预先柱前衍生化方法，使用邻苯二甲醛（OPA）进行衍生，并通过荧光检测。如前所述，剩余的中和样品将使用离子交换树脂进行提取，用于气相色谱-质谱联用（GCMS）分析，以测定氨基酸和有机酸中的同位素富集度，如下一节所示。为制备珠粒，分别向 G1 和 G50 珠粒中加入一当量盐酸。在1升烧杯中，使用磁力搅拌器分别搅拌每种珠粒30分钟。随后，用去离子水洗涤珠粒10次，直至洗涤液的pH值与水的pH值相同。接下来，我们将展示如何使用玻璃移液管自制低成本的层析柱。预装柱也可从商业途径获得。制备层析柱时，用镊子将一小团棉花置于巴斯德移液管尖端最狭窄处的上方，用于有机酸提取的G-1凝胶珠和G-50凝胶珠。进行氨基酸提取时，将每根层析柱填充至柱高约三分之一处。如果样品的pH值已为中性，则在上样至AG 1型层析柱前无需向样品中添加任何物质。为提取有机酸以进行氨基酸提取，在将样品上样至AG 50型层析柱前，需向样品中加入1毫升0.1当量的盐酸。现在将先前制备的中和样品分别加入各柱中。用去离子水洗涤每个柱子10次，直至洗出液呈中性。洗涤完成后，将各柱洗脱至预先标记的4毫升玻璃样品小瓶中。进行有机酸提取时，向AG 1型柱中加入3毫升3摩尔/升的盐酸。这允许分析三碳物种、四碳物种、五碳物种和六碳物种中标记碳原子总数的同位素富集情况。进行氨基酸提取时，向AG 50柱中加入三毫升4 N氢氧化铵。这允许分析三碳物种和五碳物种中标记碳原子总数的同位素富集情况。完成有机酸和氨基酸提取后，将样品管放入三通道反应仪中过夜蒸发，直至完全干燥。随后，样品经衍生化处理，并按照方案文本中的详细说明进行气相色谱-质谱（GCMS）分析。本实验步骤开始时，将一千条年轻成虫期线虫转移至含有碳13全标记葡萄糖和大肠杆菌的实验用35毫米NGM琼脂平板中。接下来，将无盖的实验用NGM平板放入一个定制的玻璃室中，该玻璃室配备了一个密封良好的三通旋塞阀，以便精确取样和更换气体环境。在光学透明玻璃圆盘与平板接触的密封处涂抹高真空润滑脂。用玻璃圆盘密封反应室。记录时间。以此时为零时，30分钟后，使用20毫升注射器通过三通旋塞从玻璃反应室中抽取10毫升气体样品。取样后，关闭通向腔室的旋塞，将样品转移至含有1毫升0.1摩尔氢氧化钠中碳酸氢钠的红色真空玻璃管中。接着，通过三通旋塞向玻璃腔室内注入10毫升空气。使用20毫升注射器，在重新注入空气后、继续孵育前，于60、90和120分钟时重复从玻璃腔室中采集空气样品。按照方案文本所述，使用气体同位素比质谱仪分析这些大气二氧化碳样品中的标记碳富集情况。稳定同位素在喂食活体或经紫外照射灭活的OP50大肠杆菌的线虫中，两小时后即可有效掺入幼年成虫体内，这一点可通过大气二氧化碳及线虫体内溶解性二氧化碳中检测到的标记碳得到证实。与释放到大气中的二氧化碳相比，线虫体内溶解性二氧化碳组分中碳13二氧化碳与碳12二氧化碳的比值更高。观察发现，若从幼虫期开始长期暴露于稳定同位素，随后将线虫转移至不含细菌的NGM平板上清除体内细菌，可提高幼年成虫体内游离谷氨酸的同位素富集水平。在此图中，L1 代表从 L1 幼虫阶段到 959 细胞的年轻成虫阶段持续喂食完全标记的碳 13 葡萄糖和 OP50 细菌的线虫，YA 代表在达到产卵第一天的年轻成虫阶段后，开始喂食碳 13 葡萄糖和 OP50 细菌 48 小时的线虫。x 轴表示每种谷氨酸分子中标记的碳原子总数，y 轴表示富集百分比。所有动物在进行下游样品制备前均已清除多余的同位素标记。进行GCMS分析时，绿色柱状图表示在PCA提取前两小时，在NGM平板上喂食OP50大肠杆菌以进行同位素暴露后清除体内同位素的线虫。蓝色和灰色柱状图分别表示在PCA提取前两小时或六小时，在不含细菌的NGM平板上进行同位素暴露后清除体内同位素的线虫，无论同位素暴露的时间进程如何。当动物在平板上清除两小时或六小时时，中间代谢物中的同位素富集程度未观察到显著差异。在两种同位素暴露条件下，当动物通过喂食未标记的细菌清除2小时后，中间代谢物中的同位素富集程度均较低。因此，对于在含有同位素的细菌涂布NGM平板上培养的线虫，确定最佳的清除方案为：在无细菌涂布的NGM平板上清除2小时，以优化中间代谢物中的同位素富集百分比。随后，在液体培养基中与一种六碳¹³C-葡萄糖共孵育24小时，不添加细菌。如图所示，比较了仅通过超声处理或超声联合研磨方式破碎的线虫样品。采用超声联合研磨破碎的线虫样品，其同位素富集程度高于仅通过超声处理的样品。最终通过在平板上从L1阶段开始，或在液体培养中从产卵第一天起作为年轻成虫持续24小时喂食活体线虫稳定同位素前体，实现标记。该方法可用于对反映糖酵解、丙酮酸代谢及三羧酸循环代谢通量的代谢物进行灵敏的同位素富集分析。该技术为线粒体疾病的研究开辟了道路，使研究人员能够探索秀丽隐杆线虫中间代谢流。观看本视频后，您应能充分理解如何在秀丽隐杆线虫中进行稳定同位素标记，以开展中间代谢和代谢流的分析。

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在开发和成年阶段的中介代谢通量的稳定同位素分析线虫</em

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