Name: 成蚊（冈比亚按蚊的RNAi实验议定书） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学习冈比亚按蚊RNAi基因沉默技术，通过胸部注射dsRNA研究病原体抗性相关基因功能。该方法为疟疾媒介生物学研究提供有效工具，助力开发病媒控制新策略。

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在蚊子中进行RNAi介导的基因沉默需要预先制备和纯化针对目的基因的特异性dsRNA。对于dsRNA合成，我们推荐使用Ambion Megascript试剂盒，该试剂盒利用T7 RNA聚合酶介导的体外转录反应。对于dsRNA纯化，我们推荐使用Qiagen RNeasy试剂盒。dsRNA样品应定量并用水调整至3 μg/μL。您还需要以下材料：尖头镊子、载玻片、玻璃微量移液针、显微注射仪（我们使用Drummond的Nanoject II）、安装在冷台上的一台体视显微镜、带盖的玻璃培养皿、纸巾和一桶冰。此外，您还需要一种收集蚊子的方法，以及适合容纳蚊子的容器和食物来源，例如浸有10%蔗糖的棉球。
<ol>
<li>收集蚊子. 使用电池供电的吸蚊器收集需要注射的蚊子。用纸巾或棉花堵住吸嘴，防止蚊子逃逸，然后取下储液管。由于低温可使蚊子麻醉，将储液管埋入装有冰块的桶中，静置5–10分钟，直至蚊子停止活动。也可通过将储液管置于低温室或冰箱中，或使用CO2实现麻醉。在等待的5–10分钟内，可继续进行下一步操作。 </li>
<li>准备操作区域. 将平板式冷台设置为2°C，并在其上放置一块载玻片，用于放置待注射的蚊子。将玻璃针头连接至显微注射仪，并使用镊子将针尖折断至所需宽度。针尖宽度应足够大，以保证液体以合理速度流出，同时又足够细，以尽量减少注射时造成的创伤。理想的针尖应细到可轻微弯曲但不会断裂。根据实验需求设定注射设备的输出体积（RNAi实验中我们使用69 nL）。按照制造商说明，将针尖浸入样品中，吸取液体样本。液体样本可以是dsRNA溶液、细菌悬液或其他类型，注射流程对所有样本均相同。将玻璃培养皿嵌入冰桶中，确保皿底完全接触冰面，用于暂时存放待注射的蚊子。 </li>
<li>准备蚊子. 将50–100只蚊子从储液管转移至玻璃培养皿中。使用镊子将其铺成单层，确保大多数蚊子与冰冷的皿底接触以维持麻醉状态。不使用时，用培养皿盖覆盖蚊子。将储液管放回冰桶中，以保持其余蚊子处于麻醉状态。 </li>
<li>将蚊子置于冷台上. 使用尖头镊子在体视显微镜下，将蚊子逐个从培养皿转移至安装在冷台上的载玻片上。操作时应轻柔，最好夹住蚊子的腿部。在载玻片上并排排列最多30只蚊子，确保每只蚊子均能被显微注射仪触及，并与冷载玻片充分接触。排列时应保持有序，以便在注射过程中清楚识别已注射和未注射的个体。其余蚊子应继续覆盖并存放于冷藏的培养皿中。 </li>
<li>注射第一组蚊子. 一手持尖头镊子，另一手像握笔一样握住显微注射仪。使用镊子根据需要移动蚊子（避免夹伤，应夹住腿部），并在注射时固定蚊子。最佳操作方式是用镊子支撑蚊子的一侧，从另一侧进行注射。小心地将针尖仅插入蚊子的胸部。应选择外骨骼紧绷但较薄的区域注射，以减少损伤。同时避免插入过深；仅需针尖进入胸腔即可，过深注射会造成更大创伤，影响存活率。当针尖到位后，踩下并释放显微注射仪的脚踏开关，即可注入预设体积的dsRNA。等待一至两秒后，将针头从蚊子体内抽出。若伤口处出现液滴，应等待数秒，使其被吸收。若数秒内未被吸收，则丢弃该蚊子并重新尝试。继续完成载玻片上所有蚊子的注射。 </li>
<li>存放蚊子. 操作完成后，将已注射的蚊子放入标记好的容器中（我们推荐使用1品脱容量、内衬蜡纸的纸杯，顶部覆盖网状纱布，并用橡皮筋和纸板盖固定）。 </li>
<li>继续注射直至完成. 持续将蚊子置于载玻片上，完成注射后转移至纸杯，直至达到所需样本量。需考虑部分死亡情况——初学者因注射创伤可能导致较多蚊子死亡。随着操作熟练，存活率将逐步提高，最终几乎可达100%。 </li>
<li>操作结束后，在纸杯上覆盖一张折叠的湿纸巾，并提供食物来源，再用保鲜膜或塑料培养皿盖等材料覆盖杯口以保持湿度。已注射的蚊子容易脱水，湿纸巾提供的水分及塑料覆盖物的保湿作用有助于防止此问题。 </li>
<li>将蚊子置于环境可控的培养箱中进行孵育。</li>
</ol>
注意：基因沉默效率具有高度变异性，取决于多种因素，包括转录本和蛋白质的周转速率，以及细胞和器官对dsRNA的摄取效率。我们发现，沉默效应最早可在注射后1天开始，并可持续至注射后6天。建议使用定量PCR和蛋白质印迹等转录本和蛋白质检测方法来验证沉默效果。
注意：蚊子注射及RNAi介导的基因沉默技术的多个步骤存在多种变异方法。其中一些变异方法在Boisson, et al. (2006) 和 Blandin, et al.(2002) 中有描述。

<ol><li>Boisson,, et al. , (2006).</li>
<li>Blandin,, et al. , (2002).</li>
</ol>

基因沉默的效率具有高度变异性，取决于多种因素，包括转录本和蛋白质的周转速率，以及细胞和器官对dsRNA的摄取效率。我们发现，沉默效应最早可在注射后1天开始，并可持续长达注射后6天。应采用转录本和蛋白质检测方法（如定量PCR和蛋白质印迹）来验证沉默效果。

<table><tbody><tr><td>Megascript</td><td>试剂盒</td><td>Ambion</td><td></td><td>用于合成双链RNA；通过T7 RNA聚合酶介导的体外转录反应</td></tr><tr><td>RNeasy</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td>用于纯化双链RNA</td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td></td><td>应定量并用水调整至 3 &amp;#x03BC;g/ &amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>细尖镊子</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃微量毛细管针</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量注射器</td><td></td><td>Drummond Scientific</td><td>Nanoject II</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td></td><td></td><td></td><td>安装在冷台上</td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td></td><td>带盖，玻璃材质</td></tr><tr><td>纸巾</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 蔗糖</td><td>食物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A. gambiae</td><td>动物</td><td></td><td></td><td>蚊子</td></tr></tbody></table>

冈比亚按蚊成蚊rnai实验方案

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频方案展示了迪莫普洛斯实验室用于将dsRNA注射到携带疟原虫的冈比亚按蚊中的方法。该技术包括注射装置的操作以及将dsRNA注射至蚊子胸部的过程。

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频方案展示了Dimopoulos实验室用于将dsRNA注入冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）的一种方法，该蚊种可携带疟原虫。本技术详细演示了注射装置的操作以及将dsRNA注入蚊子胸部的过程。

冈比亚按蚊成蚊RNAi实验方案

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体的抗性相关基因方面极为有效。本视频……

我是Lindsay Garver，是约翰·霍普金斯大学公共卫生学院George Dimopoulos博士实验室的一名博士生。我将向您展示如何通过注射技术实现RNAi介导的基因沉默。第一步是收集我们将要注射的蚊子。这些只是普通的果蝇品系，数量非常多。它们是雄性和雌性的混合物。这是我们使用的电池供电的吸虫器。其内部有一个风扇，能够产生吸力，将蚊子通过这个吸嘴吸入到储存室中。因此，我们先拔掉电源，打开一个小型检修门（通常用胶带封住以防止蚊子逸出），打开门后插入吸嘴，开启电源即可进行采集。将蚊子放入后，我们堵住喷嘴的顶部，可以看到蚊子位于储液腔内。接下来需要对这些蚊子进行麻醉。因此，我们将该储液腔埋入装有冰块的冰桶中，静置等待蚊子完全麻醉。 接下来，我们需要对蚊子进行显微注射。为此，我们将使用这种名为 NanoJet Two 的仪器。它包含一个手持的探针部分，我将手持该部分。探针上装有针头，用于将液体注入蚊子体内。控制面板上有填充和排空按钮，负责将液体吸入和排出针头。然后这是底座，将放置在地面上。用脚踩下装置将把一滴适当体积的液体注入蚊子体内。在蚊子处于冰上时，我们通过将冷台设置为0至2摄氏度来准备工作站。该冷台配有平面附件，其上安装有一块载玻片。这可以防止蚊子在我们对其进行操作时移动。我还将取用一根玻璃毛细管针。这是一根普通的玻璃毛细管，中间经过加热和拉伸处理，从而形成针状结构。这将用于盛装我们的液体。然后，我们将使用它来向蚊子注射并释放液体。因此，接下来我们需要将毛细玻璃针安装到我们的注射探针上。我们取下鼻锥。确保内部环圈按照制造商的说明进行安装。将玻璃针头向下滑入鼻锥中，操作时注意针尖，以免折断。固定好之后，将移液管的针头插入毛细管针头中，并拧紧前端部件。下一步是确保毛细管针头的直径适合注射。这一点非常重要，因为针头过细会导致液体无法准确释放，而针头过粗则可能损伤蚊虫，甚至导致其死亡。这需要大量练习，但合适的宽度对于正确注射和蚊虫的存活至关重要。我的做法是使用尖头镊子将针尖折断，使针头仍具有一定的柔韧性，同时保持稳定。我们需要双链RNA样品。本样品使用试剂盒制备。市场上有多种试剂盒可用于生成针对目的基因的特异性双链RNA。我们将RNA的使用浓度设为每微升3微克，并将纳米注射仪设定为每次注射量为69纳升。将装有针头的管子插入液体中，使用n eject上的填充按钮将液体吸入针头。针头中所需液体的量与您要注射的蚊虫数量成正比。明白了吗？接下来我们需要准备蚊虫。我们将塑料P2培养皿放入装有冰块的桶中。检查蚊子是否不再活动，并将它们均匀地平铺在冰冷的培养皿上。这样可以确保我们在操作过程中，蚊子保持静止，不会移动或飞走。然后将蚊子放置在已冷却至零摄氏度的载玻片上。蚊子的摆放位置对于注射操作至关重要，因此需要将蚊子有序排列，以便明确区分哪些已经注射，哪些尚未注射。同时，蚊子

protocol-for-rnai-assays-in-adult-mosquitoes-a-gambiae

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科研

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Biology

生物学

成蚊（冈比亚按蚊的RNAi实验议定书）

本视频展示了在实验室中饲养冈比亚按蚊的一般技术。通过该生物体从幼虫到蛹再到吸血成虫的整个生命周期，演示了实验室蚊虫饲养的各个环节。...

冈比亚按蚊（A. gambiae）的饲养方案

在本实验方案中，我们结合RNAi介导的基因沉默与体内利尿测定法，研究目标基因敲降对蚊虫体液排泄的影响。...

RNAi介导的基因敲低和 体内 成年雌性个体利尿实验 埃及伊蚊 蚊子

RNA-Seq 分析在揭示非模式生物适应性状分子基础方面正变得越来越重要。本文介绍了一项从蚊子饲养、RNA测序到RNA-Seq数据的生物信息学分析，用于鉴定滞育与非滞育状态的白纹伊蚊（Aedes...

一种用于亚洲虎蚊Aedes albopictus光周期滞育研究的RNA-seq实验与生物信息学分析方案

传播疟疾的蚊子具有一些重要的流行病学特征，这些特征只能通过分子技术进行检测。我们利用基于 MALDI-TOF 的 SNP...

一种用于检测传播疟疾蚊虫的多指标检测方法

本文介绍了一种通过使用可被幼虫摄食的壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒来抑制疾病媒介蚊虫基因功能的方法。...

壳聚糖/干扰RNA纳米颗粒介导的病媒蚊虫幼虫基因沉默

RNA干扰（RNAi）是揭示基因功能的极为重要的工具。然而，在主要的人类疟疾传播媒介冈比亚按蚊（Anopheles...

向Anopheles gambiae蛹体内递送RNAi触发物

本方案描述了一种我们已标准化并多年用于将特定量的核酸直接递送至蚊子和家蝇血淋巴的显微注射方法。该方案可实现极低的注射死亡率，并允许进行与剂量相关的繁殖力测定。...

蚊虫与家蝇中可重复的dsRNA显微注射及产卵生物测定

双组分GAL4-UAS系统是一种多功能工具，可用于在可控的时空条件下调控基因表达，从而在Anopheles...

利用GAL4-UAS系统在Anopheles gambiae中进行功能遗传学研究

本方案提供了从DNA提取到数字液滴PCR（ddPCR）实验建立的完整步骤，包括在gRNA引导的Cas9切割及DNA修复后，对靶位点处非同源末端连接（NHEJ）事件进行鉴定与定量的分析方法。该方法的其他应用还包括多态性检测和基因编辑变异体验证等。...

利用数字液滴PCR检测基因改造按蚊群体中的插入缺失突变

本文详细介绍了一种利用高分辨率熔解分析对埃及伊蚊（Aedes...

利用高分辨率熔解分析在蚊子Aedes aegypti中检测CRISPR/Cas9诱变后的插入缺失

通过细菌产生的双链RNA（dsRNA）进行口服给药，是一种常用于Caenorhabditis...

有效的口服RNA干扰（RNAi）给药至成年Anopheles gambiae蚊子

学习冈比亚按蚊RNAi基因沉默技术，通过胸部注射dsRNA研究病原体抗性相关基因功能。该方法为疟疾媒介生物学研究提供有效工具，助力开发病媒控制新策略。

冈比亚按蚊成蚊RNAi实验方案

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