胶粘剂基于磁带的采样和荧光组合原位杂交快速检测沙门氏菌新鲜农产品
2010年10月18日
本协议描述了简单的基于磁带的粘合剂为番茄等新鲜农产品表面取样的方法，全细胞快速检测沙门氏菌用荧光原位杂交（FISH）。
该程序的总体目标是将基于胶带的新鲜农产品采样与使用 C 2 杂交（也称为鱼）中的快速荧光对沙门氏菌物种进行全细胞分子检测相结合。这是通过首先将胶带贴在所需材料上并提取表面结合的细胞来实现的。电池充电带可以直接分析，也可以进行固相或液相富集。
该程序的第二步是在胶带上，对于在肉汤中暗示或富集在肉汤中的细胞，在乙醇系列中进行自固定和脱水。第二步涉及将细胞固定在悬浮液中，然后将细胞悬浮在储存缓冲液中。该程序的第三步是使用沙门氏菌特异性寡核苷酸探针混合物进行快速磁带杂交步骤，然后用洗涤缓冲液冲洗去除多余的探针（对于通过传真分析的样品），鱼步骤在悬浮液中进行，并且可以在分析前使用简单的稀释步骤去除多余的探针。
该程序的最后一步是用 DPI 对杂交的条带结合细胞进行复染，并使用荧光显微镜检查它们。对于基于事实的分析，不需要复染。最终，该方法提供了一种对采样新鲜农产品中可能存在的沙门氏菌种类进行目视或细胞术检测的方法。
我第一次想到这种方法是在读到一个意大利小组使用类似的方法来检查罗马航空石遗迹上的细菌群落时。但是 r 和我在一门我教授的关于食品微生物学快速方法的课程中领导了对这项工作的讨论。几周后，可追溯到新鲜农产品的沙门氏菌疫情开始爆发，最终导致 43 个不同州的近 1500 人患病。
虽然我们的实验方法为检测新鲜农产品上的特定细菌类型提供了一种及时实用的途径，但它也足够便携，可以在现场或食品生产环境中进行测试。首先选择要用于采样的磁带。一些选项包括市售的 fungi tape 或 contacted，它们是无菌的，并且还进行了包装以方便使用。
用永久性记号笔，使用无菌铝模板在 10 厘米胶带的非病面画一厘米的正方形。这将作为一个视觉指南，用于记录胶带的哪一部分用于对食品或环境表面进行采样，形成一个 CS 形胶带环，粘性面朝向要采样的表面。为此，请用拇指和中指握住粘性末端，然后将食指靠在胶带背面绘制的正方形上。
将胶带放在要采样的表面上，轻轻地将标记区域压在表面上，不要松开胶带的边缘。使用食指确保胶带的粘性面与样品表面完全接触。使用均匀的动作避免气泡。
慢慢地将胶带从样品上拉开。物理提取表面结合的微生物可以固定电池电荷。将粘性面向上粘在显微镜载玻片上 使用通用的透明办公胶带，确保胶带的适当张力和拉伸，从而形成平坦、无皱纹的表面。
这将有助于最大限度地减少胶带变形或卷曲的问题。在随后的加热过程中。在杂交过程中，将胶带面朝下放在木糖切片三级 4 或 XLT 四个农业板上，使采样细胞与农业表面直接接触，以便于从农业表面轻松去除胶带。
富集后，将胶带的模板化样品接触部分与农业表面齐平放置，并将胶带的一端松散地粘附在胶带上。培养皿板的侧壁倒置以避免冷凝，并在 35 摄氏度下孵育。为了允许沙门氏菌种类充分生长，将细胞富集到可检测水平所需的潜伏期长度将取决于初始沙门氏菌污染水平。
在所需的富集期后，打开琼脂板，胶带在孵育过程中将保持其粘性。用食指轻轻地将胶带压在琼脂上，以确保最大限度地回收形成的微菌落在胶带琼脂界面处，从附着在培养皿壁上的边缘抓住胶带，然后以缓慢均匀的动作将其取下。使用通用的透明办公胶带将电池充电胶带粘性面朝上安装在显微镜载玻片上，以形成平坦、无皱纹的表面。
在25 摄氏度下用 500 μL 10% 中性缓冲福尔辛覆盖样品接触区域，在胶带细胞上固定 30 分钟。将固定剂丢弃到化学罩下的可密封容器中，以尽量减少接触刺激性或有毒蒸气，用 PBS 轻轻浸润胶带表面，用磷酸盐缓冲盐水或 PBS 清洗胶带一次，使样品脱水。使用渐进乙醇系列，使用商业分子生物学级溶液过滤器，使用 22 微米注射器制备预杂交杂交和洗涤缓冲液，并将杂交和洗涤缓冲液预热至 55 摄氏度。
将荧光标记的寡核苷酸探针添加到预热的杂交缓冲液中，使最终探针浓度为每微升 5 ng，用 300 微升杂交缓冲液覆盖胶带的模板化样品接触区域，该杂交缓冲液含有探针混合物和杂交胶带结合细胞，在设置为 55 摄氏度的潮湿密封培养室中，用于直接接触培养箱， 如滑动模式仪器杂交 15 分钟。杂交后，去除载玻片并丢弃含有杂交缓冲液覆盖层的探针。通过移液，用预热的洗涤缓冲液短暂而轻轻地冲洗。
倾斜载玻片上的少量缓冲液可让载玻片风干，以便通过荧光显微镜检测沙门氏菌种类。用约 10 μL 载体盾牌 H 1200、含有 dpi 的封固剂覆盖载玻片，核复染剂在黑暗中孵育 10 分钟。将浸油放在盖子上，滑动并使用高倍率油物镜检查样品。
DPI 滤镜用于使样本聚焦。然后将显微镜切换到适当的滤光片，根据沙门氏菌细胞的绿色或红色荧光对沙门氏菌细胞进行目视评分，具体取决于用于标记探针的染料。前周期检测将 PBS 悬浮样品转移到 5 毫升圆底采样管中，并使用激发波长为 647 纳米的流式细胞仪进行检查。
使用 FlowJo 软件分析数据。从人工污染的番茄表面对 terica 血清型 Ty Murium 进行胶带采样，有助于通过显微镜或流式细胞术细胞电荷直接进行鱼后分析。使用沙门氏菌特异性 DNA 探针的组合在 C 2 杂交中处理磁带以进行快速荧光，并用德克萨斯红标记，具体取决于磁带上沙门氏菌细胞的初始局部浓度。
固相富集产生的结果范围从分离的微菌落到汇合生长。磁带采样的细胞可以通过 fish 和流式细胞术相结合进行分析，可以在采样后立即或在液体表面 5 小时后进行分析。在 35 摄氏度下进行小型培养富集。
尽管我们已经描述了胶带鱼技术在食品安全方面的使用，但该方法在其他学科中也有很好的应用潜力，包括环境微生物学、植物病理学或临床微生物学。与该程序同时，可以对胶带提取样品中的固相或液相富集进行生化检测或 PCR 等其他实验。测试可用于回答有关可能存在的沙门氏菌的问题，这些问题超出了 FISH 程序的范围。
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概述
本协议描述了一种使用粘胶带对新鲜农产品表面（如番茄）进行采样的方法。它能够通过荧光原位杂交（FISH）快速检测沙门氏菌。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 食品安全
- 分子生物学
背景
- 沙门氏菌是一种重要的食源性病原体。
- 传统的沙门氏菌检测方法可能耗时较长。
- 荧光原位杂交（FISH）允许快速检测。
- 粘胶带采样是一种新颖的表面采样方法。
研究目的
- 开发一种简单的新鲜农产品表面采样方法。
- 实现沙门氏菌的快速分子检测。
- 改进农产品处理的食品安全协议。
使用的方法
- 使用粘胶带收集表面附着的细胞。
- 细胞固定和乙醇系列脱水。
- 使用针对沙门氏菌的特异性寡核苷酸探针混合物进行杂交。
- 通过荧光显微镜进行样品洗涤和分析。
主要结果
- 成功从新鲜农产品表面提取沙门氏菌。
- 通过FISH方法实现快速检测。
- 展示了粘胶带采样的有效性。
- 提升食品安全措施的潜力。
结论
- 粘胶带方法是一种可行的采样选择。
- FISH提供了一种快速检测病原体的技术。
- 这种方法可以整合到食品安全实践中。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid, culture-independent detection of foodborne pathogens like Salmonella on fresh produce surfaces supports early risk assessment in the food safety testing workflow. The adhesive tape-FISH method enables direct sampling and molecular identification without enrichment delays, providing timely data for go/no-go decisions in produce supply chains. This approach enhances predictive confidence in contamination screening and reduces reliance on slower culture-based methods.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of surface-associated microbial presence for hypothesis testing in food safety models.
- Operational Value: Provides a simple, portable sampling technique compatible with field and production environment use.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts via microscopy or flow cytometry for Salmonella detection.
- Operational Value: Supports assay standardization through fixed tape mounting, probe hybridization, and washing steps.
- Strategic Value: Facilitates scalable screening of multiple produce types using the same tape-FISH workflow.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system modeling by detecting Salmonella on fresh produce surfaces under controlled conditions.
- Operational Value: Allows seamless transition from sampling to enrichment (solid or liquid phase) and downstream analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing early, actionable contamination data.
Pipeline & Workflow Integration
The tape-FISH method fits within the early discovery continuum, supporting initial hazard detection before proceeding to more detailed characterization or enrichment-based workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding surface microbial load and distribution on fresh produce matrices.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs via FISH signal detection, enabling comparison across sampling conditions.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts compatible with microscopy and flow cytometry for single-cell analysis.
- Translational Research: Connects surface sampling to enrichment strategies that model pathogen growth in food-relevant environments.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable sampling module applicable across multiple produce types and testing sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in pathogen detection through direct, culture-independent molecular identification.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fixed sampling areas, controlled fixation, and standardized hybridization.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing time-to-result and enabling rapid screening of high-volume produce lots.
- Portfolio Impact: Informs risk-based prioritization of lots for further testing or release based on rapid Salmonella detection outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy or flow cytometry for signal detection and analysis.
- Needs access to hybridization incubators, wash stations, and reagent preparation for probe handling.
- Demands standardized tape application and fixation protocols to ensure consistent cell extraction and retention.
- Involves adaptation considerations for different produce surface textures and topographies.
- Includes practical limitations related to probe specificity and background fluorescence from complex food matrices.
