器官型切片文化绿色荧光蛋白表达的实时成像周围神经生长的小鼠胚胎
March 29th, 2011
我们现在准备妊娠中期的小鼠胚胎的器官切片周围神经生长的培养和时间推移成像的方法。
该程序的总体目标是制备表达小鼠胚胎的 GFP 前肢区域的器官型横向切片，以对脊神经生长进行成像。这是通过首先将胚胎包埋在低熔点 aros 中并将组织和 aros 的区域限制在感兴趣的区域来实现的。然后挂载 aros 块进行切片。
然后用振动器将嵌入块中的胚胎切片。该过程的最后一步是去除切片周围的 aros 并将切片转移到培养板中。然后培养切片并显示周围神经向外围生长，这可以用荧光显微镜监测。
与断头台或组织切碎机等现有方法相比，该技术的主要优点是切片以更可控的方式生成，并在培养中显示出更好的活力。因此，这种方法可以帮助发育神经生物学的研究，例如观察脊神经的引导和生长，证明该程序将是伊莎贝尔·巴曼。通过用 6 毫升培养基和 3 厘米毫细胞 cm、0.4 微米培养膜插入物制备 10 厘米的组织培养板来开始此过程。
将它们保存在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中。接下来，在微波炉中加热 4% 低熔点的 PBS 中的物质，并将其放在加热板上，使其保持在 37 摄氏度左右。用 PBS 填充 10 厘米的细菌培养皿，并将其置于冰上。
然后设置 Viome 冷却装置。将缓冲盘和冷却元件存放在冰箱中，直到完全冷冻以进行胚胎。首先从子宫中嵌入解剖胚胎。
用倒置荧光显微镜检查它们并检查 GFP 表达。接下来，使用 watman 纸条将胚胎放在倒置的 10 厘米培养皿上，以定向它们并去除过量的 PBS。在胚胎上涂抹 aros 以修复它。
在定向位置，等待 aros 凝固，修剪过多的 aros，如果需要，还可以在胚胎中间部分周围组织。将嵌入的胚胎旋转到另一侧。在胚胎组织上应用额外的 aros 以确保胚胎完全嵌入。
等待 aros 凝固。准备边缘干净的胚胎嵌入的 aros 块。最后，将样品粘在 Viome 卡盘上，用 Loctite 4 0 6 粘住。
设置预冷的缓冲盘和冷却元件。将带有胶合纸巾的卡盘放在 viome 上。在卡盘中加入一个 X-H-B-S-S，直到组织被覆盖。
将预先清洁的 viome 刀片插入刀架中。接下来，准备厚度约为 350 至 450 微米的横向切片。使用 HM six 50 V 切片机切割每个切片。
用缩短的玻璃牧场移液管将切片转移到组织培养板上，并保持在冰上。使用一把镊子，小心地从所有切片中取出 aros。然后将切片转移到 milli 细胞培养膜上，每个膜上排列 4 个切片，转移到装有 6 mL 预热培养物的 10 厘米培养板中。中等。
在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育切片，直到延时成像开始和成像间隔之间。将含有带有切片的 Millie 细胞培养膜的组织培养板置于正置荧光显微镜下，并使用 4 x 10 x 或 20 x 物镜定位脊神经成像脊神经生长物。在显微镜载物台上标记 milli 细胞培养膜的方向，以便在下一个成像时间点正确重新定位，以防温度和二氧化碳不稳定。
此处显示的环境是在纯合 tau GFP 胚胎的横向切片中培养 24 小时期间脊神经生长的成像系列。星号表示腹侧脊髓的运动神经元，箭头表示 DRG。上面板使用 4 X 物镜成像，下面板使用 10 X 物镜成像。
看完这个视频后，你应该对如何准备可用于对脊神经生长进行成像的小鼠胚胎的器官型横向切片有一个很好的了解。
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概述
本文介绍了一种制备中期妊娠小鼠胚胎器官型切片的方法，特别针对前肢区域用于研究脊髓神经发育。该方法允许使用荧光显微镜进行外周神经发育的时间推移成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 成像技术
背景
- 器官型切片对于在受控环境中研究神经发育至关重要。
- GFP表达的小鼠胚胎为神经发育提供了视觉标记。
- 荧光显微镜使得能够实时监测外周神经生长。
- 理解神经发育对于洞察发育过程和潜在的治疗应用至关重要。
研究目的
- 开发一种从小鼠胚胎中制备器官型切片的可靠方法。
- 在实验室环境中促进脊髓神经发育的成像。
- 增强对外周神经发育的理解。
使用的方法
- 将中期妊娠小鼠胚胎嵌入低熔点阿拉伯树脂中。
- 将组织区域限制在感兴趣的区域以进行重点研究。
- 使用振动切片机切割包含胚胎的阿拉伯树脂块。
- 将切片转移到培养板中进行观察。
主要结果
- 成功从小鼠胚胎中制备器官型切片。
- 观察到外周神经向外周发育。
- 有效地使用荧光显微镜监测神经发育。
- 展示了切片在长期培养中的活力。
结论
- 该方法为研究外周神经发育提供了宝贵的工具。
- 器官型切片可用于神经科学的各种实验应用。
- 这种方法可能会带来对神经发育和再生的新见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables real-time imaging of peripheral nerve outgrowth in organotypic slice cultures, providing a controlled system for evaluating neuroactive compounds and genetic manipulations. It supports target validation in neurodevelopmental pathways by allowing direct visualization of axonal growth and guidance mechanisms. The approach enhances predictive confidence in early discovery by modeling age-specific nerve development in a reproducible, physiologically relevant format.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to axonal guidance and nerve outgrowth mechanisms.
- Operational Value: Provides a neuron-specific readout via GFP expression for functional target validation in developing peripheral nervous system.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by allowing real-time monitoring of neurogenic responses to pharmacological or genetic perturbations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized 300-400 micrometer slices with consistent viability for up to two days in culture.
- Quantitative Output: Enables measurement of nerve outgrowth throughout the culture period using fluorescence microscopy.
- Scalability: One litter yields ~14 slices, supporting medium-throughput screening of compound effects on neurite extension.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral nerve development processes applicable to neuropathic injury and regeneration studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical assessment of neuroregenerative compounds.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go determinations based on observed nerve outgrowth patterns in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in neurodevelopmental biology and enabling lead identification through quantitative nerve outgrowth analysis.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and biological de-risking of targets involved in spinal nerve guidance and peripheral innervation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence-based readouts suitable for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides time-lapse imaging data that enables statistical comparison of outgrowth dynamics across experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical models by maintaining age-specific developmental processes in slice culture.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neurotoxicity, neuroregeneration, and target validation studies across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through direct visualization of peripheral nerve development in a genetically tractable system.
- Operational Value: Ensures reproducibility via vibratome-based slicing and standardized culture conditions on Millicell inserts.
- Strategic Value: Improves portfolio triage by reducing mechanistic ambiguity in neurodevelopmental target engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on validated nerve outgrowth phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo dissection, fluorescent microscopy, and vibratome sectioning.
- Dependent on low melting point agarose, vibratome equipment, and sterile culture infrastructure.
- Necessitates standardization across teams for slice thickness, culture timing, and imaging parameters.
- Adaptation to other model systems may require optimization of embedding and slicing parameters.
- Practical limitations include slice viability window (~2 days) and dependence on transgenic GFP expression for visualization.
