Name: 器官型切片文化绿色荧光蛋白表达的实时成像周围神经生长的小鼠胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-29T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 学习制备小鼠胚胎器官型切片的方法，用于实时成像GFP标记的脊髓神经外周生长。该技术结合荧光显微镜，为发育神经生物学研究提供可控且高存活率的实验平台。

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作者感谢最初提出在小鼠胚胎上进行切片培养想法的原始来源5。我们感谢 Joachim Kirsch 提供慷慨的科学支持，以及 Anna Degen 在拍摄期间担任我们的助理。本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft：Sonderforschungsbereich 488，子项目 B7/B9）和海德堡大学（卓越集群 Cellular Networks）资助。

第1部分：切片与培养的准备工作。
<ol>
	<li>准备10 cm组织培养皿，加入切片培养基（DMEM、25% 1×HBSS、25%胎牛血清、0.5%葡萄糖、1 mM谷氨酰胺、2.5 mM HEPES，pH 7.3），并放入3 cm Millicell-CM 0.4-μm培养膜插件，置于37°C、5% CO2培养箱中备用。</li>
	<li>将4%低熔点琼脂糖在PBS中用微波炉加热溶解，随后置于加热板上保温，使其温度维持在约37°C。</li>
	<li>在10 cm细菌培养用培养皿中加入PBS（140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4），并置于冰上冷却。</li>
	<li>设置好切片机冷却装置，或确保缓冲液托盘和冷却元件已预先存放在冰箱中进行预冷。</li>
</ol>
第2部分：胚胎包埋。
<ol>
	<li>从子宫中分离胚胎，并使用倒置荧光显微镜观察胚胎以检测 GFP 表达情况。</li>
	<li>将胚胎置于倒置的 10 cm 培养皿中，并用 Whatman 滤纸条调整胚胎位置，以去除多余的 PBS。</li>
	<li>在胚胎上覆盖琼脂糖，使其固定在此位置，待琼脂糖凝固。</li>
	<li>用刀片切割周围区域，限定胚胎周围的范围。</li>
	<li>将包埋的胚胎翻转至另一侧。</li>
	<li>在胚胎组织上添加额外的琼脂糖，确保胚胎完全包埋。</li>
	<li>修整琼脂糖块使其边缘平整，然后使用 Loctite 406（一种类似于“Krazy Glue”的特殊胶水）将其固定在振动切片机的卡盘上。</li>
</ol>
第3部分：切片操作步骤。
<ol>
	<li>安装预冷的缓冲液托盘和冷却元件。</li>
	<li>插入带有粘附组织的样品头，并加入1×HBSS（无Ca2+、Mg2+的HBSS，10 mM HEPES缓冲液，pH 7.3，500 U/ml青霉素/链霉素），直至完全覆盖组织。</li>
	<li>安装并固定已预先清洁（70%乙醇）的切片机刀片。</li>
	<li>制备350–450 μm的组织切片，并使用截短的玻璃巴斯德吸管将切片转移至置于冰上的组织培养板中。</li>
	<li>使用一对镊子小心地从每一片切片上去除琼脂糖，并将其转移至Millicell培养膜上。每个10 cm组织培养板中加入6 mL培养基，其上的一个培养膜可培养约4片切片。</li>
	<li>将切片在37°C和5% CO2条件下孵育（培养基：DMEM，25% 1×HBSS，25%胎牛血清，0.5%葡萄糖，1 mM谷氨酰胺，2.5 mM HEPES，pH 7.3）。若进行延时成像系列实验，应保持培养基体积恒定。若仅进行短时间的定时成像，可维持原有培养基不变；对于较长时间的培养，建议在12–20小时后更换培养基。</li>
</ol>
第4部分：在显微镜下成像脊神经的轴突生长。


<ol>
	<li>将含有脊髓神经切片的Millipore培养膜置于10 cm的组织培养皿中，并将其放置在直立式荧光显微镜下，对脊髓神经进行成像。</li>
	<li>在显微镜载物台上标记Millipore培养膜的方向，以便在下一次成像时间点能够正确放置。</li>
	<li>使用4倍（数值孔径[NA] 0.1）、10倍（NA 0.3）或20倍（NA 0.5）物镜对脊髓神经的轴突发芽进行成像。</li>
</ol>
图1显示了在4倍和10倍物镜下培养20小时期间脊神经突起生长的成像序列。
<img src="/files/ftp_upload/2309/2309fig1.jpg" alt="胚胎神经生长延时成像；显微镜图像；4小时，14小时，24小时；发育分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1 纯合tauGPF胚胎横切面中脊神经外延生长的成像序列。* = 脊髓腹侧的运动神经元，箭头 = 背根神经节（DRG）。图中显示了切片的背侧（D）-腹侧（V）轴。比例尺：200 μm。

<ol><li>Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+are+required+for+nerve+growth+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins are required for nerve growth during development.</a> Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).</li>
<li>Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slice+culture+system+for+the+imaging+of+nerve+development+in+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse.</a> Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).</li>
<li>Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+of+identified+projection+neurons+in+cat+visual+cortex+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices.</a> J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).</li>
<li>Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo slices.</a> Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).</li>
</ol>

在对制备中期妊娠小鼠胚胎（E10 - E12）脑片培养方法的广泛比较中，我们观察到，无论从整体培养物的存活率还是神经突起生长模式的可重复性来看，使用振动切片机（vibratome）均无疑能获得最可靠的结果。相比之下，采用McIlwain组织切片器制备的脑片完全无法存活3。我们最初曾使用一种斩切法4，即通过将钨丝依次缠绕在切割格栅上，同时对一整窝胚胎进行切片，以获得400-μm厚的切片1。尽管该方法具有制备速度快的优点，但每个胚胎最多仅能得到一个可存活的切片，且神经突起生长参数存在较大变异。基于上述原因，我们认为尽管振动切片法制备耗时较长，但仍为更优选择。尽管该方法必须依赖振动切片机，但其结果远优于其他“低技术”手段，因此该设备的投入是合理的。

<table><tbody><tr><td>HBSS 10倍浓缩液</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14180</td><td></td></tr><tr><td>解剖工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>多种</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖（L.M.P. agarose）</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td></td></tr><tr><td>沃特曼滤纸（Whatmann paper）</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030917</td><td></td></tr><tr><td>短头火焰抛光移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素双抗溶液（Pen Strep）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 100倍浓缩液</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机（Vibratome）</td><td>Microm International</td><td>HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>analySIS 软件</td><td>Soft Imaging System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM 细胞培养小室插件</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG 50</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633171</td><td></td></tr><tr><td>乐泰 406 瞬干胶（LOCTITE 406）</td><td>Henkel Corp</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9105.2</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>×4 物镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>PL 系列</td><td></td></tr><tr><td>×10 物镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLFL &amp;#8211;PH 系列</td><td></td></tr><tr><td>滤光片</td><td>Olympus Corporation</td><td>U-MNIBA2</td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Soft Imaging System</td><td>SIS F-View II</td><td></td></tr><tr><td>加热培养室设备</td><td>Leica Microsystems</td><td>CTI-Controller 3700 和培养箱 S #11531171</td><td></td></tr></tbody></table>

表达gfp的小鼠胚胎器官型切片培养用于外周神经突起实时成像

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

出于多种目的，小鼠胚胎的培养 离体 作为器官型切片是可取的。例如，我们采用一种转基因小鼠品系（tauGFP) 其中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）特异性表达于发育中的中枢和周围神经系统的所有神经元中1，从而能够对前肢的神经支配过程进行活体成像，并利用药理学和遗传学手段对该过程进行干预和调控2成功培养此类脑片培养物最关键的参数在于脑片的制备方法。经过对多种方法的广泛测试，我们发现，使用振动切片机（vibratome）是切割胚胎的最佳方式，该方法能够常规地获得可在数天内保持活性的培养物，更重要的是，组织能够以符合特定发育阶段的方式正常发育。对于中期妊娠胚胎而言，这包括脊神经从脊髓和背根神经节正常延伸至外周靶组织，以及骨骼和肌肉组织的正确分化。 
本研究介绍了一种将胚胎发育第10至12天（E10至E12）的完整胚胎加工成300至400微米厚切片的方法，这些切片可在标准组织培养孵育箱中培养，并在切片制备后持续观察长达两天。该方法成功的关键在于使用振动切片机对包埋于琼脂糖中的胚胎进行切片。随后将切片置于Millipore培养膜插入物上，并使其接触少量培养基，从而实现界面培养技术。一窝平均7个胚胎通常可获得至少14个切片（每个胚胎可获得2至3个前肢区域切片），具体数量因胚胎年龄及切片厚度略有差异。约80%的培养切片可观察到神经突起生长，可在整个培养期间进行测量2。本文展示了利用tauGFP小鼠品系获得的代表性实验结果。

我们介绍一种制备中期妊娠小鼠胚胎的器官型切片的方法，用于外周神经突起的培养和延时成像。

表达GFP的小鼠胚胎器官型切片培养用于外周神经突起实时成像

出于多种研究目的，将小鼠胚胎在体外以器官型切片形式进行培养是可取的。例如，我们使用一种转基因小鼠品系（tauGFP）来……

本实验的总体目标是制备表达GFP的小鼠胚胎前肢区域的器官型横切片，以观察脊神经的生长情况。该目标通过首先将胚胎包埋于低熔点琼脂糖中，并将组织和琼脂糖的范围限制在目标区域来实现。随后将琼脂糖块固定并进行切片。然后用振动切片机对包埋在包埋剂中的胚胎进行切片。该操作步骤的最后一步是去除切片周围残留的琼脂糖，并将切片转移至培养板中。随后对切片进行培养，可观察到周围神经向外生长进入周围组织，可通过荧光显微镜进行观察。与现有的剪切法或组织切片机等方法相比，该技术的主要优势在于切片的制备过程更为可控，并且在培养中表现出更高的存活率。因此，该方法有助于发育神经生物学的研究，例如观察脊神经的导向和轴突生长。演示该实验操作的将是 Isabel barman。开始本实验前，需准备直径10厘米的组织培养皿，每皿中加入6毫升培养基，以及直径3厘米的 Millicell CM、孔径0.4微米的培养膜插入物。将它们置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。接下来，将4%低熔点琼脂糖在PBS中用微波炉加热融化，并将其放置在加热板上，使其保持在约37摄氏度。用PBS填充10厘米的细菌培养用培养皿，并将其置于冰上。然后设置 Viome 冷却装置。将缓冲托盘和冷却元件存放在冰箱中，直至完全冻结，以用于胚胎包埋。首先从子宫中解剖分离胚胎。使用倒置荧光显微镜观察样本，并检测GFP表达情况。随后，将胚胎置于倒置的10厘米培养皿中，利用沃特曼滤纸条调整其方向，并去除多余的PBS。在胚胎上施加aros以固定样本。在定向位置等待包埋剂凝固，修去多余的包埋剂，必要时可切除胚胎中段周围的部分组织。将包埋好的胚胎旋转至另一侧。在胚胎组织上再添加包埋剂，确保胚胎完全包埋。等待琼脂糖凝固。制备边缘整齐的包埋胚胎的琼脂糖块。最后，使用Loctite 4 0 6将样品粘附在振动切片机的样品夹头上。安装预冷的缓冲液托盘和冷却元件。将粘有组织的样品头放置在viome上。向样品头中加入一滴X-H-B-S-S，直至覆盖组织。将预先清洁的振动切片刀片插入刀片架中。接着，使用HM650V切片机制备厚度约为350至450微米的横切片。每个切片均使用HM650V切片机进行切割。用截短的玻璃巴斯德移液管将切片转移至组织培养板中，并保持在冰上。使用一对镊子，小心地从所有切片上去除aros。然后将切片转移至Milli细胞培养膜上，每张膜放置四个切片，置于含有6毫升预温培养基的10厘米培养皿中。将组织切片在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育，直至开始进行延时成像以及在各次成像间隔期间。将含有Milli细胞培养膜及组织切片的组织培养板置于直立式荧光显微镜下，定位脊神经，并使用4倍、10倍或20倍物镜观察脊神经的生长情况。标记Milli细胞培养膜在显微镜载物台上的方向，以便在下一个成像时间点能够准确复位，以防环境不具备温度和二氧化碳稳定控制条件。此处显示的环境是在纯合 tau GFP 胚胎横切片中培养 24 小时期间脊神经生长的成像序列。星号标记了脊髓腹侧的运动神经元，箭头指示背根神经节（DRG）。上图使用 4 倍物镜成像，下图使用 10 倍物镜成像。观看本视频后，您应能够充分了解如何制备可用于成像脊神经生长的鼠胚器官型横切片。

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