小龙虾腿部伸肌上高输出与低输出神经肌肉接头的生理记录

本实验的总体目标是演示如何在螯虾伸肌中通过形态学染色和电生理记录来暴露并区分时相性和紧张性运动神经末梢。该过程首先从一只中等大小的螯虾上掐下第一或第二步足，切除节肢段外骨骼并移除屈肌，从而暴露伸肌及神经束。

该操作步骤的第二步是使用四种乙基氨基无菌染料和甲基腹膜碘化物（或称4D2asp）对制备样本进行染色，以观察轴突和神经末梢。第三步是选择性地刺激紧张性或时相性神经元，同时对肌纤维中诱发出的兴奋性突触后电位（EPSP）进行细胞内记录。最后一步是使用局灶电极从神经末梢记录自发性和诱发出的量子事件（quanta events）。

最终，可通过免疫荧光显微镜和电生理学方法，在形态学和生理学上区分紧张性与时相性突触末梢，并获得相应结果。该方法有助于解答突触生理学领域中关于肌肉疲劳、突触抑制及突触串扰等关键问题。实验开始时，需小心抓取小龙虾，避免被其螯足夹伤。

在基节与体部分离处将步足取下。用力夹住基节可促使小龙虾发生自切反应，使第一对步足自然脱落。小龙虾出血停止后，将其放回饲养容器中。

不需处死小龙虾。将腿放在一张滤纸上，以便在切割时能够轻松翻转标本。旋转腿部，直到外侧即外侧面朝上，置于解剖板上。

通常将弧形一侧朝上。使用连接在手术刀片断裂器上的锋利剃须刀片，按照图中所示的模式在基节节段内刻划几丁质表皮。沿基节与腕掌关节从背侧至腹侧切割时，注意不要向远端切得过深。

此切割会在底层腿部肌肉上方的梅特（meite）上形成一个窗口。暂时保留角质层。将标本置于含有螯虾生理盐水的解剖皿中。

此时，用精细镊子将一根针插入腕节段中部以及基节段背侧，在远端轻轻提起角质层上已切开的窗口，用剃刀将屈肌纤维从角质层上分离。继续由远端向近端方向切割，最后将角质层的窗口完全取下。为了暴露伸肌，必须去除覆盖其上的屈肌。

用针将屈肌的肌腱从屈肌上分离。然后在跗跖关节处切断肌腱。如图所示，在切断前需非常小心地将肌腱从腿腔中拉出，并确保仅切断肌腱，避免损伤位于肌腱内侧的主要腿部神经。

用镊子夹住肌腱被切断的部位，沿环抱方向提起屈肌，将其从腿部剥离。为暴露伸肌神经，需在腕跗关节处切断主腿神经，并小心地将主腿神经向后剥离，覆盖至伸肌上方。通过轻柔地将主腿神经的远端残端向制备样本的一侧牵拉，可更清晰地分离伸肌神经与主腿神经。在将主腿神经向后剥离并覆盖至伸肌上方时，可能需要切断抑制性轴突的一些细小分支。

可通过亚甲蓝染色观察神经束。然而，在此顶部图像中，亚甲蓝不会用于电生理记录。红色箭头标记感兴趣的神经轨迹。

感兴趣的神经束是位于meropod近端处主腿神经附近分出的较粗神经束。注意观察神经内的轴突分支以及两条清晰可见的轴突。现在神经和肌肉已暴露，准备实验所用的装置。

细胞内和细胞外记录使用标准的前置放大器和放大器完成。我们采用Axon Clamp 2B放大器和一个XLU前置放大器。需要三根电极，其中一根用于细胞内记录，另两根用于细胞外记录。

两个细胞外电极将用于刺激神经，并记录突触诱发的和自发的定性事件。将聚焦电极在加热元件上进行火焰抛光，并略微弯曲。用生理盐水填充聚焦电极后，将其放入刺激电极夹持器中，并插入刺激器导线，使其与生理盐水接触。

将其连接至一个Grass P 15刺激隔离单元，该单元再连接至S 88 Grass刺激器。在进行电生理记录期间，使用D-2-ASP活性染料对轴突进行染色以实现轴突可视化：用含有5微摩尔D-2-ASP染料的生理盐水替换浴槽中的盐溶液，持续5分钟。5分钟后，重新用螯虾生理盐水充满培养皿，将标本置于显微镜下，并使用Forex物镜进行观察。

在10倍目镜下，将刺激电极移动至目标区域。下一步是将大斑块刺激电极的管腔置于紧张性或时相性轴突上。这幅四染料双染色制备样品的照片显示，由于线粒体含量较高，紧张性轴突的可见亮度更高。

在荧光显微镜下，紧张性神经末梢表现出大量的串珠样膨大，而时相性神经末梢则更为纤细。使用20倍物镜将电极置于紧张性或时相性轴突上。此处电极正被放置在紧张性轴突上。

将细胞内电极放入显微操作器中，并将细胞内电极插入伸肌肌肉细胞内。该步骤用于记录细胞内兴奋性突触后电位（EPSP）。用于记录定性EPSP。

将第二个聚焦电极放入显微操作器中。操作方法是取下之前使用的细胞内电极及其电极架，并更换为洁净的电极架。使用显微操作器将第二个聚焦电极的尖端精确置于一个突触膨大处的正上方。

通过向电极施加测试电流脉冲来测定电极电阻和封接电阻。在我们的实验中，封接电阻范围为0.3至1兆欧，电极电阻范围为0.5至1兆欧。在记录过程中可持续监测兆欧级封接电阻。

准备开始刺激时，打开示波器5.0软件并开始刺激分离的轴突。在神经束中，紧张性轴突由吸吮电极刺激，而肌纤维的兴奋性突触后电位（EPSP）则通过细胞内或细胞外电极记录。EPSP通过PowerLab森林接口记录到计算机中。

在刺激紧张性轴突后，可将刺激电极移至时相性轴突，并在神经刺激后重复实验。细胞内电极记录由紧张性和时相性运动神经元活动引发的兴奋性突触后电位（EPSP）。紧张性神经肌肉接头的突触易化作用依赖于神经刺激频率，如本实验所示，每串约20次刺激、频率为60赫兹的连续刺激串所展示的结果。

注意多次刺激时发生的易化现象。该图比较了以不同频率刺激紧张性神经时产生的兴奋性突触后电位（EPSP）的幅度：蓝色为20赫兹，绿色为40赫兹，红色为60赫兹。注意在较高刺激频率下表现出显著的易化现象。紧张性神经末梢的突触效能较低，但表现出明显的易化反应。

此处单独显示紧张性EPSP，然后在相同尺度下叠加相位性反应。与紧张性终末相反，相位性终末具有较高的量子效能，但在高频刺激下表现出突触衰减。相位性终末的突触衰减也与刺激频率相关，如此处所示。

持续以5赫兹刺激30分钟会抑制神经肌肉接头的反应。使用更高频率的刺激时，该标本在适当刺激下会更快地产生抑制。螯虾的神经肌肉接头产生非峰电位的兴奋性突触后电位（EPSPs）。

这些兴奋性突触后电位可用于研究构成这些肌肉分级电信号的定性特性。此处展示的是紧张性末梢的定性突触反应。注意，并非所有刺激试验都会引发定性事件。

通过低频刺激诱发的每个反应，可以直接计数微小事件（quantal events）。对于紧张型神经末梢，可轻松确定微小事件的数量。通过计数微小事件，也可用相同方法记录相位性运动神经元的突触反应。

然而，诱发电位具有多种性质。平均性质含量通过偏转的平均幅度或面积，以及自发事件的平均峰值幅度或面积来估算。最后提醒一下，在剥离屈肌时需小心操作，以免损伤正在等待的伸肌神经。

就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。