Name: 小龙虾腿伸肌高和低输出NMJs生理录音 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学习小龙虾腿伸肌神经肌肉接头的电生理记录技术，通过染色和细胞内记录区分紧张型与相位型运动终末。该方法结合形态学与电生理学手段，为突触生理学研究提供重要实验基础。

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感谢肯塔基大学英语系 Craig D. Slaven 先生提供的编辑协助。本研究由肯塔基大学生物学系、本科教育办公室及文理学院资助。

1）引言
运动神经元在突触处与肌纤维进行通信，这些突触 collectively 被称为神经肌肉接头（NMJ）。在大多数螯虾肌肉制备标本中，NMJ易于观察和研究。许多螯虾的NMJ表现出非峰电位的兴奋性突触后电位（EPSP），类似于哺乳动物中枢神经系统突触后树突中产生的分级电信号，或在脊椎动物NMJ中观察到的阈下反应（Wiersma &amp; Van Harreveld, 1938；Katz &amp; Kuffler, 1946）。因此，螯虾NMJ可作为基础突触模型，为突触传递和突触分化的普遍机制提供重要见解。
通常，运动单位通过神经肌肉接头（NMJ）处的突触传递类型以及肌肉的特性来调控动物行为的各个方面。自从首次在蟹和螯虾的闭肌中观察到“快”和“慢”肌肉收缩现象以来（Lucas, 1907, 1917），类似的肌肉收缩分化也已在其他类型的螯虾肌肉中得到描述，例如腹部屈肌（Kennedy &amp; Takeda, 1965a, b）和附肢伸肌（Van Harreveld &amp; Wiersma, 1936）。“快”收缩引发快速反应，例如螯虾的尾部翻转即为一种快速行为。“慢”收缩则维持缓慢运动并有助于姿势保持（Bradacs et al., 1997）。与“快”和“慢”肌肉收缩相对应，“成簇/高输出”和“紧张性/低输出”这两个术语被广泛用于描述运动神经元。肌肉收缩频率和时序的差异部分源于突触前结构和突触强度的差异（King et al., 1996）。肌原纤维蛋白异构体的表达在收缩差异中也具有重要作用；但在某些制备样本中，例如腿部伸肌，单根肌纤维同时接受两种类型的运动神经元支配，因此研究重点在于神经末梢的突触差异，因为这些末梢共享同一个靶细胞（Mykles et al., 2002）。早期研究曾分析了腿部伸肌的两条兴奋性运动轴突，并描述了其成簇型和紧张型表型（Bradacs et al., 1997）。在本报告中，我们演示了如何进行解剖并获取记录，以便其他研究人员能够进一步探究这些神经末梢突触分化的特性。
通过透射电子显微镜观察，从螯虾腿部伸肌上获取的紧张型和时相型神经末梢的连续切片系列显示，紧张型末梢中的RRP囊泡数量多于时相型末梢；紧张型神经元中的线粒体更为丰富，而时相型末梢上的突触比低输出型突触更为复杂，因其含有多个活性区且间距各异（Miller et al, 2002；Johnstone et al., 2008；King et al., 1996；Bradacs et al., 1997）。此外，低输出的紧张型末梢在神经调质5-羟色胺（5-HT）作用下增强突触传递的能力也强于时相型末梢（Cooper et al., 2003）。
紧张性突触和时相性突触存在于同一肌纤维上，这一特点使得在同一肌纤维上评估突触前差异，以及研究肌肉疲劳、突触抑制和突触间串扰等问题变得更加容易。该制备模型中仍存在诸多尚未解决的问题，例如紧张性和时相性神经末梢的突触后靶区是否存在突触后受体密度或谷氨酸受体亚型的差异。然而，对这两种运动单位在解剖学和生理学上的基本差异获得更深入的理解，将有助于建立更为扎实的知识体系。希望在此突触制备模型中获得的基本原理能够适用于其他制备模型中的突触，并推动未来对螯虾突触模型的进一步研究。
2）方法
<ol>
<li> 所有实验均在中等体型的克氏原螯虾（Procambarus clarkii）的第一或第二步足上进行。动物被单独饲养在装有充氧水的塑料容器中。动物饲养室的温度保持在13°C–16°C之间。每周喂食一次干燥鱼粮，并更换水。 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig1.jpg" alt="甲壳类步足解剖图，标注各节段：基节、腕节、指节。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图1： 克氏原螯虾步足示意图及远端六个节段。</li>
<li> 克氏原螯虾步足的远端在解剖学上分为六个节段（图1）。伸肌位于腕节内，而待分离的神经束靠近腕节与坐节之间的关节。在暴露后，可根据生理实验需要选择性刺激紧张性或时相性轴突。</li>
<li> Cooper 和 Cooper（2009年）描述了部分初始解剖步骤，包括在腕节区域暴露开肌运动神经元兴奋支的方法，但其描述未涉及保护伸肌免受损伤的必要操作，因为该研究无需保留伸肌。为保护伸肌，需从体长6–10 cm的克氏原螯虾（Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA）上取下第一或第二步足，方法是用力夹持坐节节段断裂面远端，诱导动物自切肢体。将步足放置于解剖板上，使外侧（外侧面）朝向观察者。旋转步足，确保其外侧（外侧面）朝上放置于解剖板，通常以弧形面朝上（图2）。将步足置于一张滤纸上，有助于在切割过程中翻转标本。 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig2.jpg" alt="甲壳类解剖图，外骨骼节段标注图，外侧视角用于研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2： 腕节的外侧（通常为弧形面）朝上放置于解剖板上。</li>
<li> 使用手术刀片折断器及刀柄，以锋利的剃须刀片沿图3所示模式在腕节节段的角质层上刻划，直至刚好切透。注意在腕节–掌节关节处进行背侧至腹侧切割时，远端切口不宜过长。 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig3.jpg" alt="昆虫触角形态图；突出显示分节结构；昆虫学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图3： 腕节节段，图中线条为建议刻划角质层窗口的路径。 将标本置于生理盐水中。解剖皿底部应涂有一层Sylgard（Dow Corning）材料（厚度1 cm）。使用Sylgard可插入昆虫针以固定标本。此时，将一根针插入掌节节段中央，另一根针插入坐节节段的背侧（图4）。解剖后的标本浸浴于标准克氏原螯虾生理盐水中，该盐水经Van Harreveld溶液（1936年）改良，成分为：205 NaCl；5.3 KCl；13.5 CaCl2·2H2O；2.45 MgCl2·6H2O；5 HEPES，用mM单位表示，pH值调至7.4。 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig4.jpg" alt="静态平衡，毛发湿度计装置用于湿度测量；毛发张力，水分吸收。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
图4： 腕节节段，角质层窗口已被掀起。注意解剖针的位置。</li>
<li> 在远端区域轻轻掀起角质层，并通过向腿基部方向划切，将肌纤维与角质层分离。随后可将角质层完全掀开。</li>
<li> 在腕节–掌节关节处切断腱（附着腱）。在屈肌腱内表面插入一根针，以标示切割位置（图5）。然后用镊子夹住已切断的部位，向尾侧方向提起，将屈肌剥离（图6），从而暴露主腿神经和伸肌。 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig5.jpg" alt="解剖步骤，特写图，神经刺激实验，生物医学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5"> 
图5： 用针将屈肌腱从屈肌上移开，以突出显示其位置。 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig6.jpg" alt="多毛纲海洋蠕虫，显微镜图像，可见刚毛细节，用于海洋生物学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 6"> 
图6： 小心切断并移除屈肌腱，避免损伤主腿神经。</li>
<li> 在腕节–掌节关节处切断主腿神经，并小心地将其向伸肌上方回拉。本研究始终使用肌肉的内侧面。通过轻轻将主腿神经远端残端拉向标本一侧，可更清晰地分离伸肌神经与主腿神经。在将主腿神经从伸肌上剥离时，可能需要切断一些小的轴突分支，这些是伸肌的抑制性运动神经元的分支。在腕节近端附近从主腿神经分出的较粗神经束即为本研究关注的目标小神经束。 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig7.jpg" alt="解剖的蚯蚓，显示内部器官，生物学教育图，用于解剖学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 7"> 
图7： 主腿神经被切断并向近端方向回拉。 该神经束可通过亚甲蓝染色（图8）或4-Di-2-ASP荧光染色（图9）观察。 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig8.jpg" alt="通过光学显微镜观察植物木质部；显示清晰方向性流动的汁液运输通道。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 8"> 
图8： 伸肌经亚甲蓝染色。注意神经内的轴突分支及两条清晰可见的轴突。红色箭头标示神经走行路径。 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig9.jpg" alt="肌肉纤维显微镜图像，显示时相性和紧张性区域，用于肌肉活动分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 9"> 
图9： 运动神经轴突经4-Di-2-ASP染色。由于线粒体含量较高，紧张性轴突染色更亮。 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10a.jpg" alt="神经元结构，显微镜图像，10微米比例尺，生物研究，细胞形态分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 10A">
图10A： 经4-Di-2-ASP染色的时相性和紧张性神经元的单个终末。注意紧张性终末上的串珠样膨大以及时相性终末的纤细形态。 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10b.jpg" alt="神经元显微镜图像；10 μm比例尺；轴突结构可视化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 10B"> 
图10B - 标注紧张性 
<img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig10c.jpg" alt="时相性神经元结构，显微镜图像，10 µm比例尺，突出显示神经通路。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 10C"> 
图10C - 标注时相性</li>
</ol>
3) 生理特征分析
<ol>
<li> 为了观察紧张性或时相性神经元的兴奋性突触后电位（EPSPs），可通过连接至Grass刺激器的负压电极（图11）刺激神经束中的一条分离轴突，同时记录肌肉内的细胞内电位（Johnstone et al., 2008）。为促进低输出神经肌肉接头（NMJs）产生易化反应，需以70 Hz频率刺激紧张性轴突；而为获得高输出NMJs的大EPSPs，则对时相性轴突施加单次脉冲刺激（1 Hz），如图12所示。EPSPs通过PowerLab/4s接口记录至计算机。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig11.jpg" alt="用于细胞结构研究的具有条纹分析的肌纤维显微镜图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 11"> 
图11： 置于神经束内单根轴突上方的刺激电极。注意绿色线条标出了两条主要轴突。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig12.jpg" alt="电生理图；显示70 Hz下紧张性-时相性电活动，2 mV刻度。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 12"> 
图12： 通过细胞内记录获得的紧张性或时相性神经元的突触后电位（EPSPs）。</li>
<li> 可利用低输出和高输出神经肌肉接头（NMJs）采用多种实验范式研究突触易化与突触抑制的性质。低输出NMJs的易化效应依赖于刺激频率，如在约20次刺激下20、40和60 Hz脉冲所显示的结果（图13）。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig13.jpg" alt="电生理图，显示在20Hz、40Hz、60Hz下随时间变化的神经反应（mV）。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 13"> 
图13： 在正常螯虾生理盐水中，以三种不同频率（20、40和60 Hz）施加一串刺激脉冲后产生的EPSPs。</li>
<li> 高输出NMJs的突触抑制速率也与刺激频率相关。图14显示以持续5 Hz频率刺激30分钟导致NMJ逐渐抑制。随着刺激频率升高，标本的抑制发生得更快（Bradacs et al., 1997）。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig14.jpg" alt="EPSP幅度随时间变化图，突触反应分析，刺激频率为0.5Hz、5Hz。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 14"> 
图14： 以5 Hz刺激诱导抑制期间时相性反应的EPSP幅度。</li>
</ol>
4) 量子化反应
<ol>
<li> 采用与描述的小龙虾开肌方法（Cooper和Cooper，2009）相似的步骤进行本实验制备。通过将大斑块记录电极的尖端置于用活体染料4-Di-2-Asp显影出的突触膨大处，直接记录可识别神经末梢单个释放位点上的量子化兴奋性突触后电位（EPSPs）。5 μM，5分钟处理，Cooper 等，1995；Magrassi 等（1987年）。可沿神经末梢记录到自发性和诱发性量子化反应。诱发性和自发性突触电位通过大斑块电极记录（Dudel，1981；Wojtowicz） 等，1991；Mallart，1993）。Kimax 玻璃管（外径：1.5 mm）经拉制并火焰抛光，制成内径为 10 至 20 μm （图15）。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig15.jpg" alt="用于细胞研究中基因编辑的显微注射技术示意图，含微量移液器。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图15"> 
图15： 大膜片记录电极的内腔。 电极腔内充满灌流液。放大器与上述细胞内记录所用的相同。可通过向电极施加测试电流脉冲来测定电极电阻和封接电阻。在我们的实验中，封接电阻范围为0.3至1.0 MΩ，电极电阻范围为0.5至1.0 MΩ。在整个记录过程中可持续监测封接电阻。</li>
<li> 低刺激频率下可直接计数量子事件。对于每次诱发反应，低输出终端的量子事件数量可轻易确定（图16）。这些直接计数有助于估算平均量子含量（Del Castillo &amp; Katz，1954；Cooper 等，1995）。由于诱发的高输出型神经肌肉接头（NMJ）会产生多囊泡诱发事件，因此可通过诱发反应偏转的平均幅度或面积，以及自发事件的平均峰值幅度或面积，来估算平均囊泡含量（quantal content）（Cooper 等., 1995). <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig16.jpg" alt="神经元EPSP波形图，显示时相性和紧张性反应，标注mEPSP，持续时间为10毫秒。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图16"> 
图16 从一个时相性和一个紧张性神经肌肉接头记录的局部电位轨迹。 <img src="/files/ftp_upload/2319/2319fig17.jpg" alt="平均量子含量分析公式，诱发性与自发性量子事件的方程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图17"> 
图17</li>
</ol>

<ol>
	<li>Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+synaptic+physiology+of+crustacean+neuromuscular+systems.">Organization and synaptic physiology of crustacean neuromuscular systems.</a> Prog. Neurobiol. 7, 291-391 (1976).</li><li>Atwood, H. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+diversity+and+differentiation:+Crustacean+neuromuscular+junctions.">Synaptic diversity and differentiation: Crustacean neuromuscular junctions.</a> Invertebrate Neuroscience. 1, 291-307 (1996).</li><li>Bradacs, H., Cooper, R. L., Msghina, M., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+physiology+and+morphology+of+phasic+and+tonic+motor+axons+in+a+crayfish+limb+extensor+muscle.">Differential physiology and morphology of phasic and tonic motor axons in a crayfish limb extensor muscle.</a> J. Exp. Biol. 200, 677-691 (1997).</li><li>Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+measurement+and+analysis+methods+compared+for+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions,+and+rat+hippocampus.">Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus.</a> J. Neurosci Methods. 61, 67-78 (1995).</li><li>Cooper, R. L., Donmezer, A., Shearer, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+sensitivity+to+5-HT+between+high-+and+low-output+terminals+innervating+the+same+target.">Intrinsic differences in sensitivity to 5-HT between high- and low-output terminals innervating the same target.</a> Neuroscience Research. 45, 163-172 (2003).</li><li>Cooper, A. S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+view+and+demonstration+of+physiology+at+the+NMJ+at+the+crayfish+opener+muscle.">Historical view and demonstration of physiology at the NMJ at the crayfish opener muscle.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+components+of+the+end-plate+potential.">Quantal components of the end-plate potential.</a> J. Physiol. 124, 560-573 (1954).</li><li>Desai-Shah, M., Viele, K., Sparks, G., Nadolski, J., Hayden, B., Srinivasan, V. K., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+synaptic+function+during+short-term+facilitation+in+motor+nerve+terminals+in+the+crayfish.">Assessment of synaptic function during short-term facilitation in motor nerve terminals in the crayfish.</a> The Open Neuroscience Journal. 2, 24-35 (2008).</li><li>Desai-Shah, M., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+mechanisms+of+Ca2++regulation+that+influence+synaptic+transmission:+Comparison+between+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Different mechanisms of Ca2+ regulation that influence synaptic transmission: Comparison between crayfish and Drosophila neuromuscular junctions.</a> SYNAPSE. 63, 1100-1121 (2009).</li><li>Dudel, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+reduced+calcium+on+quantal+unit+at+the+crayfish+neuromuscular+junction.">The effect of reduced calcium on quantal unit at the crayfish neuromuscular junction.</a> Pfl gers Arch. 391, 35-40 (1981).</li><li>Griffis, B., Moffett, S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+phenotype+remains+unaltered+after+limb+autotomy+and+unloading.">Muscle phenotype remains unaltered after limb autotomy and unloading.</a> J. Exp. Zool. 289, 10-22 (2001).</li><li>Harata, N., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Mozhayeva, M., Kavalai, E. T., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+numbers+of+recycling+vesicles+in+small+CNS+nerve+terminals:+implications+for+neural+signaling+and+vesicular+cycling.">Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling.</a> Trends in Neurosci. 24, 637-643 (2001).</li><li>Jeromin, A., Shayan, A. J., Msghina, M., Roder, J., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacean+frequenins:+molecular+cloning+and+differential+localization+at+neuromuscular+junctions.">Crustacean frequenins: molecular cloning and differential localization at neuromuscular junctions.</a> J. Neurobiol. 41 (2), 165-175 (1999).</li><li>Johnstone, A. F. M., Kellie, S., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+depression+in+phasic+motor+nerve+terminals+and+influence+of+5-HT+on+docked+vesicles.">Presynaptic depression in phasic motor nerve terminals and influence of 5-HT on docked vesicles.</a> The Open Neuroscience Journal. 2, 16-23 (2008).</li><li>Katz, B., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+of+the+nerve-muscle+system+in+Crustacea.">Excitation of the nerve-muscle system in Crustacea.</a> Proc. Roy. Soc. B. 133, 374-389 (1946).</li><li>Kennedy, D., Takeda, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflex+control+of+abdominal+flexor+muscles+in+crayfish.+I.+The+twitch+system.">Reflex control of abdominal flexor muscles in crayfish. I. The twitch system.</a> J. Exp. Biol. 43, 211-227 (1965).</li><li>Kennedy, D., Takeda, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflex+control+of+abdominal+flexor+muscles+in+crayfish.+II.+The+tonic+system.">Reflex control of abdominal flexor muscles in crayfish. II. The tonic system.</a> J. Exp. Biol. 43, 229-246 (1965).</li><li>King, M. J. R., Atwood, H. L., Govind, C. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+features+of+crayfish+phasic+and+tonic+neuromuscular+junctions.">Structural features of crayfish phasic and tonic neuromuscular junctions.</a> J. Comp. Neurol. 372, 618-626 (1996).</li><li>LaFramboise, W., Griffis, B., Bonner, P., Warren, W., Scalise, D., Guthrie, R. D., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+type+specific+myosin+isoforms+in+crustacean+muscles.">Muscle type specific myosin isoforms in crustacean muscles.</a> J. Exp. Zool. 286, 36-48 (2000).</li><li>Logsdon, S., Johnstone, A. F. M., Viele, K., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synaptic+vesicles+pools+within+motor+nerve+terminals+during+short-term+facilitation+and+neuromodulation.">Regulation of synaptic vesicles pools within motor nerve terminals during short-term facilitation and neuromodulation.</a> J. Applied Physiol. 100, 662-671 (2006).</li><li>Lucas, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+complex+excitable+tissues+by+their+response+to+electric+currents+of+short+duration.">The analysis of complex excitable tissues by their response to electric currents of short duration.</a> J. Physiol. 35, 310-331 (1907).</li><li>Lucas, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+summation+of+propagated+disturbances+in+the+claw+of+Astacus+and+on+the+double+neuromuscular+system+of+the+abductor.">On summation of propagated disturbances in the claw of Astacus and on the double neuromuscular system of the abductor.</a> J. Physiol. 51, 1-35 (1917).</li><li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+that+stain+living+nerve+terminals.">Fluorescent probes that stain living nerve terminals.</a> J. Neurosci. 7, 1207-1214 (1987).</li><li>Millar, A. G., Bradacs, H., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+relationship+between+release+probability+and+readily+releasable+vesicles+in+depressing+and+facilitating+synapses.">Inverse relationship between release probability and readily releasable vesicles in depressing and facilitating synapses.</a> J. Neurosci. 22, 9661-9667 (2002).</li><li>Millar, A. G., Zucker, R. S., Ellis-Davies, C. G., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensitivity+of+neurotransmitter+release+differs+at+phasic+and+tonic+synapses.">Calcium sensitivity of neurotransmitter release differs at phasic and tonic synapses.</a> J. Neurosci. 25, 3113-3125 (2005).</li><li>Msghina, M., Govind, C. K., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+structure+and+transmitter+release+in+crustacean+phasic+and+tonic+motor+neurons.">Synaptic structure and transmitter release in crustacean phasic and tonic motor neurons.</a> J. Neurosci. 18, 1374-1382 (1998).</li><li>Msghina, M., Millar, A. G., Charlton, M. P., Govind, C. K., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+entry+related+to+active+zones+and+differences+in+transmitter+release+at+phasic+and+tonic+synapses.">Calcium entry related to active zones and differences in transmitter release at phasic and tonic synapses.</a> J. Neurosci. 19, 8419-8434 (1999).</li><li>Mykles, D. L., Medler, S. A., Koenders, A., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillar+protein+isoform+expression+is+correlated+with+synaptic+efficacy+in+slow+fibres+of+the+claw+and+leg+opener+muscles+of+crayfish+and.">Myofibrillar protein isoform expression is correlated with synaptic efficacy in slow fibres of the claw and leg opener muscles of crayfish and.</a> 205 (4), 513-522 (2002).</li><li>Sparks, G., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT+offsets+homeostasis+of+synaptic+transmission+during+short-term+facilitation.">5-HT offsets homeostasis of synaptic transmission during short-term facilitation.</a> J. Applied Physiol. 96, 1681-1690 (2004).</li><li>Sohn, J., Mykles, D. L., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical,+physiological+and+biochemical+characterization+of+muscles+associated+with+the+articulating+membrane+in+the+dorsal+surface+of+the+crayfish+abdomen.">The anatomical, physiological and biochemical characterization of muscles associated with the articulating membrane in the dorsal surface of the crayfish abdomen.</a> J. Exp. Zool. 287, 353-377 (2004).</li><li>Tsien, R. W., Harata, N. C., Choi, S. W. P. y. l. e., Aravanis, A. M., AM, G. C. h. e. n. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicles,+quanta+and+synaptic+plasticity.+Molecular+Mechanisms+of+synaptic+function.">Vesicles, quanta and synaptic plasticity. Molecular Mechanisms of synaptic function.</a> , (2001).</li><li>Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+physiological+solution+for+freshwater+crustaceans.">A physiological solution for freshwater crustaceans.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34, 428-432 (1936).</li><li>Van Harreveld, A., Wiersma, C. A. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triple+innervation+of+the+crayfish+muscle.">The triple innervation of the crayfish muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 22, 667-667 (1936).</li><li>Wiersma, C. A. G., Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+the+frequency+of+stimulation+on+the+slow+and+fast+contraction+in+crustacean+muscle.">The influence of the frequency of stimulation on the slow and fast contraction in crustacean muscle.</a> Physiol. Zool. 11, 75-81 (1938).</li><li>Wojtowicz, J. M., Smith, B. R., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+recruitment+of+silent+synapses.">Activity-dependent recruitment of silent synapses.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 627, 169-179 (1991).</li></ol>

未声明任何利益冲突。

本报告中，我们展示了如何在一个独特的螯虾神经肌肉标本上进行突触反应的分离、记录和量化，该标本中高输出和低输出的神经末梢共同支配同一条肌纤维。与脊椎动物的神经肌肉接头相比，螯虾的神经肌肉标本具有诸多优势：仅需少数几个兴奋性运动神经元即可支配一块肌肉，且神经元在不同制备样本之间具有可识别性（Atwood, 1976）。此外，其兴奋性神经递质为谷氨酸，兴奋性突触后电位（EPSP）呈等级性变化，因此这种等级性事件的生物物理特性与脊椎动物中枢神经系统（CNS）神经元树突的特性相似。然而，量子化电流可直接在突触后位点进行监测（Cooper et al., 1995）。
对时相性神经施加重复的 5 Hz 刺激会引发较大的兴奋性突触后电位（EPSP），但在数分钟后这些电位会显著减弱。这种类型的突触抑制在节肢动物的时相性神经肌肉接头中较为常见（Atwood 和 Cooper，1996）。由于紧张性末梢与时相性末梢并存，研究者可借此评估在时相性运动神经元发生抑制期间及之后，突触后靶细胞是否发生了显著改变。此外，低输出型末梢为研究突触易化背后的机制提供了一个理想的实验体系（Desai-Shah 等，2008；Desai-Shah 和 Cooper，2009）
高输出端为研究突触抑制速率的调制及其恢复过程提供了理想的实验平台。可及且存活良好的标本有助于阐明突触抑制背后的机制。在此螯虾腿部伸肌标本中，外源性施加5-羟色胺是研究突触抑制恢复的另一种工具，也可能为进一步探究突触囊泡池的动员机制提供手段。该标本具有多种实验优势，因为单个肌纤维同时受到时相性和紧张性运动神经元的支配。
由于5-羟色胺能够增加在诱发刺激下释放的囊泡数量，并且在突触抑制期间促进功能恢复，显然5-羟色胺的存在会对囊泡池进行某种调节，从而提高囊泡融合的概率（Johnstone et al., 2008；Logsdon et al., 2006；Sparks et al., 2004）。在该实验体系可采用的各种实验方案中，还需考虑能够解释低频刺激条件下、而非抑制状态下，突触前神经末梢内囊泡池动态变化的模型。
在其他系统中已发现，约30%的囊泡池经历快速再循环，而其余回收的囊泡则通过内质网进行传统的慢速再循环路径（Harata et al., 2001；Tsien et al., 2001）。此类双重路径在此系统中也可能存在。如果突触前末梢处于抑制状态时缺乏ATP，则停靠与解离过程可能无法进行，从而导致更多未装载的囊泡滞留在突触表面。由于当末梢暴露于5-HT时会迅速释放更多囊泡，因此可以推测在可立即释放囊泡池（RRV）中包含的囊泡数量更多。然而，在ATP减少的抑制状态下，即使存在5-HT，停靠与解离过程仍可能被阻断，这再次导致未装载的囊泡滞留在突触表面。由于初步数据表明，随着5-HT长时间暴露和刺激，随时间推移释放的囊泡数量增加，因此来自快速和慢速再循环路径的囊泡池分布可能偏向于具有可再次释放能力的成熟囊泡（来自Johnne et al., 2008；参见综述—Desai-Shah et al., 2008；Desai-Shah和Cooper，2009）
通过聚焦大斑片记录突触后电流的技术以及从运动神经末梢特定区域测量单个量子事件的方法，可以探究突触抑制的发生是由于释放的囊泡数量减少，还是由于突触后受体功能的改变所致。已有研究表明，在相同的钙暴露条件下，该制备模型中紧张型神经肌肉接头（phasic NMJ）的囊泡对融合更为敏感（Miller et al. 2005），这很可能解释了紧张型末梢具有较高的平均量子含量的原因（Msghina et al., 1998, 1999）。此外，钙结合蛋白frequein的差异（Jeromin et al., 1999）以及超微结构的不同（King et al., 1996）也共同导致了突触效能的差异（Cooper et al., 2003）。

一些先前的研究已探讨了伸肌纤维的肌肉表型（Bradacs et al., 1997；Cooper et al., 2003）。将龙虾中完全张力型和时相型纤维类型的肌肉分化调控与混合型纤维类型（如受低频神经支配的腿部伸肌）进行比较，可能为肌肉表型的表达与调控机制提供线索（LaFramboise et al., 2000；Sohn et al., 2000；Griffis et al., 2001；Mykles et al., 2002）。
神经生物学领域仍有许多基本问题有待解决，而该实验准备可能有助于探讨其中部分问题。当前该领域内一些值得关注的研究方向可借助腿部伸肌系统进行探究，包括：1）确定高输出突触末端突触抑制现象背后的细胞机制（抑制是否源于Ca2+内流减少、缺乏足够数量的可立即释放囊泡（RRV）池，和/或突触后敏感性改变？）；2）明确5-HT在突触抑制诱导后促进恢复速度的机制性作用；3）确定在诱导抑制过程中，由刺激时相性末端引发的量子化电流波形是否发生变化，以区分突触前与突触后成分在突触抑制中的贡献。
该神经肌肉接头对于当前的研究和未来的科研人员具有重要意义，因为它使我们能够获得与突触传递性能相关的关键信息，这些信息是直接在递质释放位点测得的。该领域的现有研究正在揭示5-HT对突触抑制的调节作用以及囊泡池的动力学特性。这些课题涉及所有神经系统中突触传递的基本原理。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;小龙虾（&lt;em&gt;Procambarus clarkii&lt;/em&gt;），购自美国路易斯安那州拉塞尔县阿查法拉亚生物供应公司（Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA）。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;标准小龙虾生理盐水：&lt;ul&gt; &lt;li&gt;参照 Van Harreveld 溶液（1936 年）改良配制（单位：mM）：205 NaCl；5.3 KCl；13.5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；2.45 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；5 HEPES，调节 pH 至 7.4&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; &lt;/li&gt; &lt;li&gt;解剖工具：精细 #5 镊子、精细剪刀、刀片夹持器、#26002-20 昆虫针（以上均购自 Fine Science Tools (USA), Inc.，地址：373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139，美国）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;涂有 Sylgard 的解剖皿，记录用培养皿可采用带负压电极的装置，或使用负压电极与另一操纵器固定负压电极。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;用于细胞内记录的体视显微镜，需具备变焦功能。对可视化末梢进行局灶记录时，使用配备直立物镜（4× 和 20×）的复合显微镜。需配备 Hg 光源。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;标准细胞内放大器及用于在线记录至计算机的 A/D 转换板。电信号通过 &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/pl3504#overview&quot; target=&quot;_blank">PowerLab/4s 接口&lt;/a&gt;（ADInstruments，澳大利亚）在线记录。我们使用 ADInstruments 公司提供的标准 &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/&quot; target=&quot;_blank">Chart 或 Scope 软件&lt;/a&gt;。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;化学试剂：&lt;ul&gt; &lt;li&gt;我们使用一种活体荧光染料——4 [4-(二乙氨基)苯乙烯基]-N-甲基吡啶碘化物（4 Di 2 Asp；Molecular Probes，尤金，俄勒冈州），用于可视化神经末梢的曲张体（Marigassi &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 1987；Cooper &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 1995a）。所有生理盐水中的化学试剂均购自 Sigma 化学公司（St. Louis, MO，美国）。&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; &lt;/li&gt; &lt;li&gt;用于细胞内记录的玻璃毛细管（美国缅因州不伦瑞克 FHC 公司产品，目录号 #30-31-0）；用于局灶大电极记录的 Kimax-51 玻璃管（Kimble Products，货号 34502，内径 0.8–1.1 mm，长度 100 mm）。细胞内电极的电阻应为 20 至 30 mΩ。大电极通过电极拉制仪拉出细尖后将其尖端折断制备而成，折断处应为直径约 20&amp;mu;m 的平整垂直断面。随后将尖端加热抛光至内径约 10&amp;mu;m。再将电极杆部通过加热元件加热，使其缓慢弯曲约 45 度。这样在微操纵器以约 45 度角操作时，电极腔面可与神经末梢保持水平或垂直。&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

小龙虾腿部伸肌上高输出与低输出神经肌肉接头的生理记录

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

我们详细说明如何暴露并记录螯虾行走腿伸肌中支配高（时相性）和低（紧张性）输出运动神经元的突触反应的电生理记录方法。时相性和紧张性神经末梢在生理和形态上存在显著差异。紧张性轴突含有更多的线粒体，因此比时相性轴突能更强烈地摄取活体染料。紧张性末梢具有膨大结构（varicosities），而时相性末梢呈丝状。紧张性末梢的突触效能较低，但表现出显著的易化反应；相反，时相性末梢的量子化释放效能较高，但在高频刺激下出现突触抑制。通过将局灶性大电极直接放置在可视化神经末梢上方，可测量其量子化输出。时相性和紧张性末梢共同支配相同的肌纤维，这表明神经元本身的固有差异，而非来自肌肉的差异性逆行反馈，是导致其形态和生理分化的根本原因。

本文演示了如何在螯虾行走腿的伸肌上进行突触反应的电生理记录，以及如何对神经末梢进行可视化，以显示高输出和低输出神经末梢在宏观形态上的差异。

我们详细说明如何暴露并进行突触反应的电生理记录，以研究高（时相性）和低（紧张性）输出的运动神经元……

本实验的总体目标是演示如何在螯虾伸肌中通过形态学染色和电生理记录来暴露并区分时相性和紧张性运动神经末梢。该过程首先从一只中等大小的螯虾上掐下第一或第二步足，切除节肢段外骨骼并移除屈肌，从而暴露伸肌及神经束。该操作步骤的第二步是使用四种乙基氨基无菌染料和甲基腹膜碘化物（或称4D2asp）对制备样本进行染色，以观察轴突和神经末梢。第三步是选择性地刺激紧张性或时相性神经元，同时对肌纤维中诱发出的兴奋性突触后电位（EPSP）进行细胞内记录。最后一步是使用局灶电极从神经末梢记录自发性和诱发出的量子事件（quanta events）。最终，可通过免疫荧光显微镜和电生理学方法，在形态学和生理学上区分紧张性与时相性突触末梢，并获得相应结果。该方法有助于解答突触生理学领域中关于肌肉疲劳、突触抑制及突触串扰等关键问题。实验开始时，需小心抓取小龙虾，避免被其螯足夹伤。在基节与体部分离处将步足取下。用力夹住基节可促使小龙虾发生自切反应，使第一对步足自然脱落。小龙虾出血停止后，将其放回饲养容器中。不需处死小龙虾。将腿放在一张滤纸上，以便在切割时能够轻松翻转标本。旋转腿部，直到外侧即外侧面朝上，置于解剖板上。通常将弧形一侧朝上。使用连接在手术刀片断裂器上的锋利剃须刀片，按照图中所示的模式在基节节段内刻划几丁质表皮。沿基节与腕掌关节从背侧至腹侧切割时，注意不要向远端切得过深。此切割会在底层腿部肌肉上方的梅特（meite）上形成一个窗口。暂时保留角质层。将标本置于含有螯虾生理盐水的解剖皿中。此时，用精细镊子将一根针插入腕节段中部以及基节段背侧，在远端轻轻提起角质层上已切开的窗口，用剃刀将屈肌纤维从角质层上分离。继续由远端向近端方向切割，最后将角质层的窗口完全取下。为了暴露伸肌，必须去除覆盖其上的屈肌。用针将屈肌的肌腱从屈肌上分离。然后在跗跖关节处切断肌腱。如图所示，在切断前需非常小心地将肌腱从腿腔中拉出，并确保仅切断肌腱，避免损伤位于肌腱内侧的主要腿部神经。用镊子夹住肌腱被切断的部位，沿环抱方向提起屈肌，将其从腿部剥离。为暴露伸肌神经，需在腕跗关节处切断主腿神经，并小心地将主腿神经向后剥离，覆盖至伸肌上方。通过轻柔地将主腿神经的远端残端向制备样本的一侧牵拉，可更清晰地分离伸肌神经与主腿神经。在将主腿神经向后剥离并覆盖至伸肌上方时，可能需要切断抑制性轴突的一些细小分支。可通过亚甲蓝染色观察神经束。然而，在此顶部图像中，亚甲蓝不会用于电生理记录。红色箭头标记感兴趣的神经轨迹。感兴趣的神经束是位于meropod近端处主腿神经附近分出的较粗神经束。注意观察神经内的轴突分支以及两条清晰可见的轴突。现在神经和肌肉已暴露，准备实验所用的装置。细胞内和细胞外记录使用标准的前置放大器和放大器完成。我们采用Axon Clamp 2B放大器和一个XLU前置放大器。需要三根电极，其中一根用于细胞内记录，另两根用于细胞外记录。两个细胞外电极将用于刺激神经，并记录突触诱发的和自发的定性事件。将聚焦电极在加热元件上进行火焰抛光，并略微弯曲。用生理盐水填充聚焦电极后，将其放入刺激电极夹持器中，并插入刺激器导线，使其与生理盐水接触。将其连接至一个Grass P 15刺激隔离单元，该单元再连接至S 88 Grass刺激器。在进行电生理记录期间，使用D-2-ASP活性染料对轴突进行染色以实现轴突可视化：用含有5微摩尔D-2-ASP染料的生理盐水替换浴槽中的盐溶液，持续5分钟。5分钟后，重新用螯虾生理盐水充满培养皿，将标本置于显微镜下，并使用Forex物镜进行观察。在10倍目镜下，将刺激电极移动至目标区域。下一步是将大斑块刺激电极的管腔置于紧张性或时相性轴突上。这幅四染料双染色制备样品的照片显示，由于线粒体含量较高，紧张性轴突的可见亮度更高。在荧光显微镜下，紧张性神经末梢表现出大量的串珠样膨大，而时相性神经末梢则更为纤细。使用20倍物镜将电极置于紧张性或时相性轴突上。此处电极正被放置在紧张性轴突上。将细胞内电极放入显微操作器中，并将细胞内电极插入伸肌肌肉细胞内。该步骤用于记录细胞内兴奋性突触后电位（EPSP）。用于记录定性EPSP。将第二个聚焦电极放入显微操作器中。操作方法是取下之前使用的细胞内电极及其电极架，并更换为洁净的电极架。使用显微操作器将第二个聚焦电极的尖端精确置于一个突触膨大处的正上方。通过向电极施加测试电流脉冲来测定电极电阻和封接电阻。在我们的实验中，封接电阻范围为0.3至1兆欧，电极电阻范围为0.5至1兆欧。在记录过程中可持续监测兆欧级封接电阻。准备开始刺激时，打开示波器5.0软件并开始刺激分离的轴突。在神经束中，紧张性轴突由吸吮电极刺激，而肌纤维的兴奋性突触后电位（EPSP）则通过细胞内或细胞外电极记录。EPSP通过PowerLab森林接口记录到计算机中。在刺激紧张性轴突后，可将刺激电极移至时相性轴突，并在神经刺激后重复实验。细胞内电极记录由紧张性和时相性运动神经元活动引发的兴奋性突触后电位（EPSP）。紧张性神经肌肉接头的突触易化作用依赖于神经刺激频率，如本实验所示，每串约20次刺激、频率为60赫兹的连续刺激串所展示的结果。注意多次刺激时发生的易化现象。该图比较了以不同频率刺激紧张性神经时产生的兴奋性突触后电位（EPSP）的幅度：蓝色为20赫兹，绿色为40赫兹，红色为60赫兹。注意在较高刺激频率下表现出显著的易化现象。紧张性神经末梢的突触效能较低，但表现出明显的易化反应。此处单独显示紧张性EPSP，然后在相同尺度下叠加相位性反应。与紧张性终末相反，相位性终末具有较高的量子效能，但在高频刺激下表现出突触衰减。相位性终末的突触衰减也与刺激频率相关，如此处所示。持续以5赫兹刺激30分钟会抑制神经肌肉接头的反应。使用更高频率的刺激时，该标本在适当刺激下会更快地产生抑制。螯虾的神经肌肉接头产生非峰电位的兴奋性突触后电位（EPSPs）。这些兴奋性突触后电位可用于研究构成这些肌肉分级电信号的定性特性。此处展示的是紧张性末梢的定性突触反应。注意，并非所有刺激试验都会引发定性事件。通过低频刺激诱发的每个反应，可以直接计数微小事件（quantal events）。对于紧张型神经末梢，可轻松确定微小事件的数量。通过计数微小事件，也可用相同方法记录相位性运动神经元的突触反应。然而，诱发电位具有多种性质。平均性质含量通过偏转的平均幅度或面积，以及自发事件的平均峰值幅度或面积来估算。最后提醒一下，在剥离屈肌时需小心操作，以免损伤正在等待的伸肌神经。就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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通过生理学和解剖学技术，研究甲壳动物步行足中关节本体感受器和肌肉张力感受器的功能与结构。...

蟹类肢体中的本体感受器与张力感受器：学生实验课程

肌肉感觉神经元参与本体感受信号传导，同时也报告代谢状态及与损伤相关事件。我们描述了一种成年小鼠 体外...

一个 体外 用于研究肌肉传入神经放电特性的成年小鼠肌肉-神经标本制备

神经肌肉接头（NMJ）的功能评估可提供有关肌肉与神经之间通信的关键信息。本文介绍了一种利用两种不同的肌肉-神经标本——即比目鱼肌-坐骨神经和膈肌-膈神经——全面评估NMJ及肌肉功能的实验方案。...

测量神经肌肉接头功能

我们描述了一种可重复、自动化且无偏倚的成像系统，该系统利用人源工程化骨骼肌组织和光遗传学运动神经元来表征神经肌肉接头功能。该系统能够随时间对神经肌肉连接的功能进行定量分析，并可检测由神经毒素及重症肌无力患者血清引起的神经肌肉功能下降。...

构建与表征人源神经肌肉接头的光遗传学模型

我们描述了一种从成年小鼠六种肌肉中获取经酶法解离的不同长度和类型的肌纤维的方案：其中三种肌肉已有报道（趾短屈肌、趾长伸肌、比目鱼肌），另外三种则是首次成功实现解离（拇长伸肌、腓骨长肌、第四趾腓骨肌）。...

通过酶解法分离小鼠六种后肢肌肉获取完整短、中、长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌的研究

学习小龙虾腿伸肌神经肌肉接头的电生理记录技术，通过染色和细胞内记录区分紧张型与相位型运动终末。该方法结合形态学与电生理学手段，为突触生理学研究提供重要实验基础。

小龙虾腿部伸肌上高输出与低输出神经肌肉接头的生理记录

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