膜电位，突触反应，神经回路，神经调节和肌肉组织学用小龙虾:学生实验室练习

以下实验的总体目标是了解可兴奋膜的特性和静息膜电位的离子基础，并学习测量膜电位以及证明突触传递特性的方法。在实验的一部分中，将在改变细胞外钾的同时测量静息膜电位。在实验的另一部分，将通过记录各种运动单位中刺激的突触反应来研究突触分化的机制。

接下来，提出了一种易于维护的神经回路。这种制剂可用于教学以及研究从 CNS 到运动神经元再到肌肉回路的感觉的各个方面。这组实验表明，使用 crayfish 模型解决与膜电位突触整合和传递以及肌肉纤维类型的结构差异相关的问题很容易。

在教授电生理学概念和技术时使用小龙虾制剂的主要优点是易于解剖、制备的最低盐水的可行性、易于获得突触反应以及易于辨别肌肉的整体解剖排列。这些技术也可以应用于其他制剂，并将进一步了解所演示制剂中的突触生理学和调节以及生化和结构差异。要开始手术，请选择一只体长约 6 至 10 厘米的小龙虾，将其放入碎冰中五分钟以麻醉以将小龙虾斩首，从后脑勺握住它，确保手指远离小龙虾的爪子和嘴巴使用大剪刀。

从小龙虾的眼睛后面干净利落地切开，快速去除头部，去除小龙虾的腿和爪子，以免受伤。去掉 male 的样式和 male 和 female 的 swimmer ettes。处理头部和附件。

接下来，沿着连接腹部和胸部的关节膜切开，将腹部与胸部分开。保存小龙虾的腹部并处理胸部，将剪刀略微向下指向腹侧，然后以一定角度沿着腹部两侧的下侧缘在壳上切开。小心不要切得太深。

使用镊子，遵循小龙虾线条的自然贝壳图案，沿着每段的长度延伸。通过向上和向后拉动外壳的腹侧部分来去除外壳的腹侧部分。注意不要破坏腹部肌肉。

去除屈肌。此时，可以在深屈肌顶部看到一团白色组织。用镊子小心地去除这些组织。

胃肠道现在可见为一条沿着深屈肌中线延伸的小管。用镊子捏住顶部并将其从腹部拉出，将其取出。切开尾部末端的胃肠道底部。

用生理盐水冲洗解剖物，以确保粪便废物不会干扰制备。使用解剖针将制剂的顶角和底角固定在 S 保护涂层的培养皿上。腹部伸肌现在暴露在外。

将盐水溶液倒入培养皿中以覆盖制备物，直到进行细胞内记录。将培养皿移至显微镜下，并在培养皿下方使用蜡以防止其移动。用于细胞内记录的装置如图所示。

随附的文本中给出了相应的连接和设置。根据说明设置实验图表软件。在随附的文本中，将地线放入盐水浴中。

将装有三摩尔氯化钾的玻璃微量移液器的尖端放入盐水浴中，并测试电极电阻。电极电阻应为 20 至 60 兆欧姆。在高强度照明下，使用放大器上的粗调旋钮将实验图表上的线条移至零。

通过显微镜观察并确定纵向 DEM 肌肉。使用电极探针将细胞内电极插入 DEM 肌肉的肌肉纤维中。电极几乎不应插入肌肉纤维中。

小心不要完全渗透到细胞中。测量静息电位的振幅。将 M 光标从图表窗口左下角的位置拖动到跟踪上。

将标记 M 放在基线上，并将光标移动到录制信号上的最低点。标记和活动光标之间的差异显示在屏幕的右上方。该值是静息膜电位的电压。

将记录的电压除以放大量，在本例中使用 10 倍放大。然后将电压从伏特转换为毫伏特。记录该肌肉纤维的静息电位后，通过显微镜观察并小心地从肌肉纤维上取下电极。

在其他肌肉纤维上重复细胞内记录。本实验的下一部分将监测提高细胞外钾浓度对静息膜的影响。将使用潜在的六种小龙虾盐水溶液，钾浓度为 5.4、20、40、60、80 和 100 毫摩尔。

选择一块不抽搐的肌肉，在记录之间进行下一次细胞内记录。用下一个更高浓度的氯化钾溶液替换浴液。确保每次都完全覆盖准备工作。

记录每种溶液的膜电位变化。提高细胞外钾浓度、膜电位的效果显示在该屏幕截图中，该屏幕截图将每种钾浓度的静息膜电位显示在细胞外钾浓度与膜电位的半对数图上。将静息电位排列在 5.4 毫摩尔细胞外钾。

对于假设曲线和观测曲线，将观测线的斜率与假设线的斜率进行比较。完成这些电生理记录后，下一步是检查肌肉纤维的解剖结构及其神经支配模式。将制备物转移到立式培养皿中，加入亚甲蓝。

五分钟后，去除亚甲蓝，加入新鲜的小龙虾盐水。寻找支配节段内肌肉的主要神经。将神经支配模式绘制到一段中的 S-E-M-D-E-L 2D EL one 和 DEM 肌肉。

接下来，将制剂移至通风橱下。去除生理盐水并加入固定剂。这里使用的固定剂是 poin 溶液。

通风橱的目的是避免固定剂的蒸汽。要非常小心，不要让这种溶液沾到您的皮肤或眼睛上。如果您的眼睛开始灼痛，请立即在洗眼器处清洗眼睛。

让 boin 溶液在制备物上停留约 10 分钟，然后用移液管将溶液交换为盐水。切下 DEL 1 或 DEL 2 肌肉的薄段。将其放在载玻片上。

为幻灯片添加标签。对 SEM 肌肉重复该过程。使用复合显微镜观察两种组织制剂中的肌节条带模式。

接下来的一系列实验将研究如何记录小龙虾腹部肌肉的突触反应。选择另一只小龙虾，将其斩首。如手术所示，切除胸部和附件，露出腹部伸肌。

在本视频的第一部分，使用显微镜找到将运动轴突输送到伸肌的神经。寻找神经最容易接近的节段。神经是白色的，可以通过使用移液管将生理盐水喷洒在制剂上或在制剂上轻轻吹气来看到。

这会导致神经移动，从而更容易识别。将微米纵器握住的抽吸电极直接放在神经上。轻轻拉动注射器，将神经吸入电极。

您可以通过显微镜看到神经被吸入电极。按照随附文章中的指定调整实验室图表软件中的设置。填充一个三摩尔氯化钾玻璃微电极，并将其连接到头部载物台和电源实验室。

使用放大器上的航向旋钮将实验图表上的线条移至零。在插入电极之前，应先打开再关闭几次拨动旋钮。为了测试电极电阻，请测量结果值的幅度。

通过显微镜观察并使用电极探针将电极插入其中一根纵向肌纤维，DEM 或 DL 1 或 DL 2。小心不要穿透肌肉纤维。现在，准备工作已为实验做好准备。

抽吸电极用于刺激节段性神经束，玻璃微电极用于记录来自肌纤维的突触反应，触发移植物刺激器以 1 赫兹刺激神经以进行阶段性反应。接下来，将电极放入 SEL 肌肉纤维中。SEL 是一种强直肌。

用 10 赫兹的短脉冲刺激神经以获得强直反应。比较记录的 DEL 和 SEL 肌肉的反应。请注意，阶段性 DEL 肌肉比强直性 SEL 肌有更大的振幅突触反应。

下一组实验侧重于小龙虾屈肌，而不是伸肌。从新的小龙虾开始，如本手术所示隔离腹部。在本视频的第一部分，将分离的尾部制备物放入装满盐水的培养皿中，固定制备物的尾部和上部。

请注意，dec Caro 在强直屈肌上进行实验时，腹侧神经索必须保持完整。使用手术刀开始纵向切割制剂腹侧两根肋骨之间的关节膜。进行此切割时要非常小心，不要切得太深，因为深切口可能会横切运动神经根，以确保浅表肌肉不受损伤。

执行下一步。使用剪刀或手术刀通过显微镜观察，从覆盖肌肉的薄膜层中的纵向切口水平切割。扩大切口以制作关节膜瓣，然后向上提起皮瓣。

用剪刀剪掉露出浅表屈肌的皮瓣，以便从浅表屈肌进行细胞内记录。使用与记录静息膜电位和腹部伸肌突触反应相同的仪器和设置。和以前一样，使用充满三摩尔氯化钾的细胞内电极。

将电极插入浅屈肌的肌纤维中，注意不要穿透肌肉。记录 EPSP 的自发活动。请注意 EPSP 的不同大小，以及是否存在任何 IPSP。

拿一支小画笔，小心地沿着包含记录电极的同一段内的角质层边缘刷。如果观察到更大的反应，请注意由于刺激而导致的 EPSP 频率或大小的任何变化。这表明募集了额外的运动神经元，响应感觉神经放电的变化。

小心地将盐水浴溶液更换为含有神经调节剂的溶液，例如一微摩尔血清素或含二氧化碳的盐水。然后重复画笔刺激。请注意更改浴液对记录的活动的影响。

将浴盐水改回生理盐水，并观察肌肉纤维活动是否恢复到基线水平。该图显示了浅表屈肌纤维中记录的 EPSP。请注意 EPSP 的不同大小。

该实验的下一阶段使用细胞外电极来监测运动神经元的动作电位，这些动作神经元对 CNS 到运动神经元回路的感觉活动做出反应。首先制作一个抽吸电极来刺激感觉神经。将一根塑料管拉到火焰上。

下一步是将管路修剪回所需的尺寸。为此，您必须在准备过程中观察神经，以判断抽吸电极所需的开口直径。根据小龙虾的大小，神经束的大小可以从直径约一毫米到几毫米不等。

切开管子的拉伸部分，使尖端的开口达到正确的大小以固定神经。如果开口太大，神经可能会脱落。如果开口太小，电极的压力可能会损害神经。

将塑料管放在玻璃管电极的尖端。与细胞内记录设置相比，电生理学和软件设置与监测细胞外反应略有不同。随附文章中指定的设备将支配浅屈肌的第三条途径吸入抽吸电极。

您现在可以开始记录动作电位。这条路线有 5 个兴奋性运动神经元和 1 个抑制性运动神经元。记录基线活动后，用刷子刺激角质层，观察产生的动作电位的变化。

在此之后，像之前的实验一样，用神经调节剂（如血清素）替换沐浴溶液，并记录反应的任何变化。随附的文本中给出了其他练习。该记录显示了在用刷子刺激角质层之前和期间从第三条途径记录的动作电位，将刷牙前的动作电位频率与刺激期间的动作电位频率进行比较。

该记录显示了在生理盐水和 5-羟色胺溶液中从第三条途径记录的动作电位。将生理盐水中动作电位的频率与它们的频率和血清素进行比较，如刚才所示。笔刷会增加基线的触发频率。

还证明活性是 5-羟色胺比生理盐水增加放电频率。该图表明，当刷牙和血清素相结合时，发射频率的增加幅度更大。外部钾浓度对静息膜电位的外部和理论衍生影响的比较表明离子对膜电位的影响。

我们还向您展示了如何记录阶段性肌和强直肌神经肌肉接头处的 ntic 反应。这些技术可用于调查学生实验室，以教授基本概念和生理学。在本实验室练习中获得的技术可用于回答与其他实验室制剂相关的问题，以及与医学和健康相关的生理应用。