Name: 膜电位，突触反应，神经回路，神经调节和肌肉组织学用小龙虾:学生实验室练习 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 16 s
Description: 学习使用小龙虾模型进行膜电位测量和突触反应记录，探索神经回路和神经调节机制。本实验通过胞内记录技术展示兴奋性膜的电生理特性，适用于神经科学教学与研究。

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由肯塔基大学生物学系、本科教育办公室及文理学院提供支持。

未声明利益冲突。

膜电位
早在1902年，伯恩斯坦（Bernstein）就开始研究枪乌贼轴突的静息电位问题。伯恩斯坦（1902）和能斯特（Nernst，1888）早期的思想和观察如何影响了膜生理学领域的后续研究，这一过程令人着迷。（参见Malmivuo和Plonsey于1995年的综述；该综述也可在以下网站获取：<a href="http://www.bem.fi/book/">http://www.bem.fi/book/</a>）。时至今日，关于离子通道功能及生物膜特性的研究仍不断取得突破，这些进展对于理解与组织、器官及系统功能相关的细胞生理学具有重要意义。
比较实验测定结果与理论推导的外界[K+]对静息膜电位的影响，可揭示离子对膜电位的作用。利用该相同制备标本，尚需开展更多实验以回答基本的生理学问题。其中一些问题早在1968年就由Atwood和Parnas提出，但至今仍未得到充分解决。通过本实验所掌握的技术，研究者可进一步探究其他实验制备体系中尚未解决的问题，以及与医学和健康相关的生理学应用问题。我们已证明，这种无脊椎动物模型制备标本在解答所有动物共有的基本生理问题方面具有重要价值。
通过上述实验中获得的关于离子电化学梯度的知识，你现在可以进一步研究膜的兴奋性，方法是通过观察小龙虾神经肌肉接头处的突触传递。

测量突触反应
本实验第一部分提供的详细说明及相关视频，介绍了记录膜电位和研究肌肉结构的关键步骤。在实验的第二部分，通过对快相型和慢相型运动单位神经肌肉接头（NMJ）处突触传递的解剖与记录演示，使学生接触到生理学中的一些基本概念。在完整动物体内观察神经回路，部分可用于解释相关行为，这种实践不仅有助于学生在实验课中探究各种开放性问题，也为未来利用这一成熟的无脊椎动物模型开展神经回路研究提供了可能（Kennedy et al., 1969; Antonsen and Edwards, 2003）
这些制备样本也可用于研究突触易化、突触抑制以及长时程可塑性（本实验室研究未涉及这些方面）。即使在某些龙虾物种内部，神经元可塑性也依赖于实验刺激条件（Mercier 和 Atwood，1989；Cooper et al.，1998）以及其自然环境。突触效能和肌肉动力学的可调节能力在多大程度上服务于动物本身，仍有待研究。由于龙虾会根据季节变化和蜕皮周期改变其行为，其神经肌肉系统存在相对较长时间的活动差异。研究表明，螯足闭合肌的时相性运动神经末梢在冬季表现出典型的时相性形态，但在夏季月份期间，神经末梢会肿胀，并在其全长上变得更加呈结节状（Lnenicka，1993；Lnenicka 和 Zhao，1991）。
一些早期在螯虾腹神经索的侧巨神经元（LG）中进行的研究证明了缝隙连接的存在（Johnson，1924；Watanabe 和 Grundfest，1961）。众所周知，CO2可通过解偶联缝隙连接来影响电突触通讯（Arellano 等，1990）。最近的研究表明，本报告中描述的感觉-中枢神经系统-运动-肌肉环路中的神经索及其通讯功能也对CO2暴露敏感，提示其中存在缝隙连接（Bierbower，2010；Bierbower 和 Cooper，2010）
3的自发活动rd 自20世纪60年代以来，运动根的自发活动机制一直备受关注。Eckert（1961）曾探讨同节段或邻近节段中张力性放电的静态肌肉受体器官（MRO）是否可解释这种自发性运动驱动。早期研究表明，该活动可能由腹神经索（VNC）内部产生，或源自更高级的中枢（Eckert，1961；Kennedy和Takeda，1965a,b；Strawn） 等，2000）。由于 CO 的存在2 停止了自发性活动后，可以推测在向运动神经元传递的通路中可能存在缝隙连接或谷氨酸能兴奋性驱动。在 CO 存在的情况下，神经肌肉接头（NMJs）被阻断或对谷氨酸的敏感性降低2，并且它们在中枢神经系统内也可能被阻断（Bierbower，2010；Bierbower 和 Cooper，2010；另见 Badre 等, 2005).
多种神经调质在各类神经肌肉接头（NMJ）中的作用也易于进行研究（Cooper 和 Cooper，2009；Griffis et al.，2000；Southard et al.，2000；Strawn et al.，2000）。此外，神经调质还会对中枢神经系统（CNS）神经回路产生多种影响。有研究提出，5-HT 和章鱼胺能神经元可能在调节神经回路输出中起到“增益设定器”的作用（Ma et al.，1992；Schneider et al.，1996；Hörner et al.，1997；Edwards et al.，2002）。在全面理解神经调质对单个靶细胞的作用之前，仍需开展大量工作。鉴于不同的神经调质可能相互协同作用，对其混合效应的分析将是未来研究的方向之一（Djokaj et al.，2001）。此外，目前针对神经调质对完整通路（可调控特定行为的通路）影响的研究仍较少，尤其是在脊椎动物中。在此感觉-CNS-运动神经元功能单元制备模型中，可同时考察感觉输入和神经调质对运动神经元活动的影响（Kennedy et al.，1969）。
由于已有假说认为5-HT在调节小龙虾、龙虾和螃蟹的行为状态中起作用（Livingstone et al., 1980；Sneddon et al., 2000），研究人员已多次尝试测定其在腹神经索（VNC）、血淋巴以及龙虾离体神经节中的浓度（Livingstone et al., 1980；Harris-Warrick 和 Kravitz, 1984；Fadool et al., 1988）。然而，所记录的测量结果存在较大差异，难以建立能够解释行为效应的明确剂量-反应关系。
人们认为，将螯足举高并将尾部 tucked 在腹部下方的小龙虾表现出一种优势姿态（Livingstone et al., 1980）。然而，小龙虾腹部屈曲的状态似乎并非在成对个体中占据优势地位的小龙虾在社会互动过程中或维持优势等级地位时所表现出的姿态（Listerman et al., 2000）。处于从属地位的小龙虾在逃离对手时，甚至会将腹部蜷缩于身体下方。这种尾部蜷缩行为也被视为一种防御姿态（Listerman et al., 2000）。这些行为在野外和实验室环境中均已被广泛观察到（Bovbjerg, 1953, 1956；Bruski 和 Dunham, 1987；Li et al., 2000；Listerman et al., 2000）。有趣的是，在龙虾中观察到的行为姿态（Livingstone et al., 1980）与在澳大利亚小龙虾 Cherax destructor 中注射5-HT和章胺后的反应相反（McRae, 1996）。在澳大利亚小龙虾的浅层屈肌制备中，可能会观察到完全不同的反应。此外，由于小龙虾的优势地位通常与其体型相关，因此可以预期其存在一个高度可塑的响应系统，以快速适应变化的社会环境（Strawn et al., 2000）。无脊椎动物对神经调质响应的可塑性仍是当前有待深入研究的领域。
Wyttenbach、Johnson 和 Hoy（1999 年）制作了数字媒体和实验手册，涵盖了本报告中所述相同肌肉以及其他小龙虾标本的各种实验。这是学生实验的优秀资源。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;李&gt;小龙虾（Crayfish）&lt;em&gt;Procambarus clarkii&lt;/em&gt;美国路易斯安那州拉克兰市，阿查法拉亚生物供应公司&lt;/li&gt; &lt;李&gt; 标准螯虾生理盐水：根据 Van Harreveld 改良&amp;rsquo;s 溶液（1936）。（单位：mM）205 NaCl；5.3 KCl；13.5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；2.45 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；5 HEPES，调至pH 7.4。血清素、谷氨酸和多巴胺用螯虾生理盐水配制。Bouin&amp;rsquo;直接使用s固定液，亚甲蓝用螯虾生理盐水配制。所有化学试剂均购自Sigma化学公司（St. Louis, MO）。&lt;/li&gt; &lt;李&gt; 解剖工具：精细#5镊子、精细剪刀、刀片 holder、#26002-20昆虫针（均购自Fine Science Tools (USA), Inc.，地址：373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139）。&lt;/li&gt; &lt;李&gt; 底部为Sylgard的玻璃培养皿&lt;/li&gt; &lt;李&gt; 烧杯（用于盛放化学溶液）&lt;/li&gt; &lt;李&gt; 电信号被实时记录到一条线上 &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML856/&quot; 目标=&quot;_blank&quot;&gt;PowerLab 26T&lt;/a&gt; 连接至计算机（ADInstruments，科罗拉多斯普林斯，科罗拉多州，美国）。我们使用标准 &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;ADInstruments 公司名为 Chart 或 Scope 的软件&lt;/a&gt;.&lt;/li&gt; &lt;李&gt; 可使用Model 3000交流/直流放大器进行细胞内和细胞外记录。&lt;/li&gt; &lt;李&gt;带有变焦功能的解剖显微镜用于细胞内记录。对可视化末梢进行聚焦记录时，使用配备直立物镜（4× 和 20×）的复合显微镜。需要汞灯作为光源。&lt;/li&gt; &lt;李&gt;用于细胞内记录时，我们使用玻璃毛细管（美国缅因州布伦瑞克 FHC 公司产品，目录号 # 30-31-0）。细胞内电极的电阻应为 20 至 30 mOhm。细胞内电极内充 3 M KCl 溶液。&lt;/li&gt; &lt;李&gt;使用吸电极记录细胞外信号。&lt;/li&gt; &lt;李&gt;法拉第笼&lt;/li&gt; &lt;李&gt;高强度照明光源（光源）&lt;/li&gt; &lt;李&gt;显微操作仪&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

利用螯虾进行膜电位、突触反应、神经回路、神经调制及肌肉组织学的学生实验

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

本报告旨在帮助理解生物膜两侧离子梯度所引起的作用。影响细胞膜电位的两个方面，也是本实验所探讨的内容：（1）膜外K+的离子浓度；（2）膜对特定离子的通透性。小龙虾腹部伸肌肌肉成群分布，其中一些属于紧张性（慢速）类型，另一些则属于时相性（快速）类型，它们在生化和生理表型以及结构上均存在差异；支配这些肌肉的运动神经元在功能特性上也相应不同。我们利用这些肌肉以及浅层的紧张性腹部屈肌来演示突触传递的特性。此外，我们引入一个感觉器-中枢神经系统-运动神经元-肌肉回路，以演示体壁感受器刺激的作用，以及神经调质对该回路某些方面的调控影响。通过本实验所掌握的技术，研究者可开始解答其他实验体系中尚存的问题，以及与医学和健康相关的生理学应用问题。我们已证明，无脊椎动物模型在探讨适用于所有动物的基本科学问题方面具有重要价值。

本实验为学生提供了一种简便的方法，以获得观察肌肉结构、突触反应以及离子梯度和通透性对膜电位影响的经验。此外，还展示了一个感觉-中枢神经系统-运动-肌肉环路，用于演示测试化合物对神经环路作用的方法。

本报告的目的是帮助理解生物膜两侧离子梯度所引起的作用。两个方面……

以下实验的总体目标是理解可兴奋膜的特性及静息膜电位的离子基础，学习测量膜电位的方法，并演示突触传递的特性。在实验的一部分中，将通过改变细胞外钾离子浓度来测量静息膜电位。在另一部分实验中，将通过记录不同运动单位中刺激诱发的突触反应，研究突触分化的机制。接下来介绍一种易于维持的神经环路。该制备方法可用于教学以及研究从感觉神经元到中枢神经系统，再到运动神经元和肌肉的环路的各个方面。这组实验展示了利用螯虾模型研究膜电位、突触整合与传导，以及不同类型肌纤维结构差异相关问题的便捷性。在讲授电生理学概念和技术时，使用螯虾标本的主要优势在于其解剖操作简便、仅需少量生理盐水即可维持标本活性、易于获得突触反应，以及便于辨识肌肉的整体解剖结构。这些技术也可应用于其他标本，有助于进一步理解突触生理与调控机制，以及所展示标本中的生化和结构差异。开始手术时，选择一只体长约6至10厘米的螯虾，将其置于碎冰中5分钟以进行麻醉；为进行断头操作，需从头部后方固定螯虾，注意避免手指接触到螯虾的螯和口器，使用大剪刀完成切断。通过在螯虾眼睛后方进行干净的切割，迅速移除头部，去除螯虾的腿和螯以避免受伤。移除雄性个体的生殖突（styles）以及雄性和雌性个体的游泳足（swimmerettes）。将头部和附肢妥善处理丢弃。接下来，沿连接腹部与胸部的关节膜进行剪切，将腹部与胸部分开。保留螯虾的腹部部分，丢弃胸部部分；将剪刀稍向下朝腹侧倾斜，并以一定角度沿腹部两侧下侧缘在壳上剪开。注意不要剪得过深，以免损伤螯虾内部结构。使用镊子沿着龙虾每个体节长度方向的天然壳纹线进行操作，小心向上并向后撕除腹侧壳部，注意不要破坏腹部肌肉。去除屈肌。此时可在深层屈肌上方看到一团白色组织。用镊子小心地将此组织去除。此时可见消化道呈一条细管，沿深层屈肌中线走行。用镊子夹住其顶端，将其从腹部拉离以移除。在尾部末端处剪断消化道的底部。用生理盐水冲洗组织样本，以确保粪便残渣不会干扰后续操作。使用解剖针将样本的顶部和底部角固定在涂有 S guard 的培养皿上。此时腹侧伸肌已暴露。将生理盐水倒入培养皿中，覆盖标本，直至进行细胞内记录。将培养皿移至显微镜下，并在培养皿下方使用石蜡固定，防止其移动。本图显示了用于细胞内记录的装置。相应的连接和设置见 accompanying text。根据说明书设置实验室图表软件。在 accompanying text 中，将接地线放入生理盐水中。将装有三摩尔氯化钾的玻璃微电极尖端放入生理盐水中，测试电极电阻。电极电阻应在20至60兆欧之间。在高强度照明下，使用放大器上的粗调旋钮将实验记录仪上的基线调至零位。通过显微镜观察，识别纵行的DEM肌肉。使用电极探针将细胞内电极插入DEM肌肉的肌纤维中。电极应仅轻微插入肌纤维内。注意不要完全穿透细胞。测量静息电位的幅度。将 M 光标从图表窗口左下角的位置拖动到轨迹上。将标记 M 置于基线上，并将光标移至记录信号的最低点。标记与活动光标之间的差值显示在屏幕右上角。该数值即为静息膜电位的电压。将记录的电压除以放大倍数，本例中使用了10倍放大。然后将电压单位从伏特转换为毫伏。记录完该肌纤维的静息电位后，通过显微镜观察，并小心地将电极从肌纤维中移出。在其他肌纤维上重复细胞内记录。本实验的下一部分将监测提高细胞外钾离子浓度对静息膜电位的影响。将使用六种螯虾任氏液，其钾离子浓度分别为 5.4、20、40、60、80 和 100 毫摩尔。在两次记录之间，选择一块没有抽搐的肌肉进行下一次细胞内记录。将灌流液更换为浓度更高的氯化钾溶液，每次更换时务必完全覆盖标本。记录每种溶液中膜电位的变化。通过提高细胞外钾离子浓度，其对膜电位的影响如本截图所示，图中以半对数坐标绘制了不同钾离子浓度下的静息膜电位，横坐标为细胞外钾离子浓度，纵坐标为膜电位。将细胞外钾离子浓度为 5.4 毫摩尔时的静息电位对齐。对于假设曲线和观察曲线，比较观察到的直线斜率与假设直线的斜率。完成这些电生理记录后，下一步是检查肌纤维的解剖结构及其支配模式。将标本转移至培养皿中，并加入亚甲蓝。五分钟后，移除亚甲蓝，加入新鲜的螯虾生理盐水。寻找支配节段内肌肉的主要神经。绘制该节段内S-E-M-D-E-L 2D EL和DEM肌肉的神经支配模式图。接下来，将样本移至通风橱下方。去除生理盐水，并加入固定液。此处使用的固定液为poin溶液。使用通风橱的目的是避免接触固定剂的蒸气。务必小心，切勿让该溶液接触皮肤或眼睛。若眼睛开始有灼烧感，应立即在洗眼站冲洗眼睛。让boin溶液在标本上保留约10分钟，然后用移液器将溶液更换为生理盐水。切取一段较薄的DEL一或DEL二肌肉组织，将其置于载玻片上。标记载玻片。对骨骼肌（SEM）重复上述操作步骤。使用复式显微镜观察两种组织样本中的肌节带状结构。接下来的一系列实验将探讨如何记录龙虾腹部肌肉中的突触反应。另取一只龙虾，将其断头，去除胸部和附肢，并按照手术图示暴露腹部伸肌。在本视频的第一部分，使用显微镜找到支配伸肌的运动轴突所经过的神经。寻找神经最易接近的节段。该神经呈白色，可通过用移液器向标本喷洒生理盐水或轻轻吹拂标本使其显现。这会导致神经移动，从而更容易识别。将固定在显微操作器上的吸电极放置在神经正上方，轻轻拉动注射器，使神经被吸入电极内。通过显微镜可以观察到神经被吸入电极的过程。根据随附文章中的说明，在实验室图表软件中调整设置。填充一支3摩尔氯化钾玻璃微电极，并将其连接至前置放大器和PowerLab系统。使用放大器上的粗调旋钮将实验记录仪上的基线调至零位。插入电极前，应将开关旋钮反复打开、关闭数次。为测试电极电阻，需测量所得数值的振幅。通过显微镜观察，并使用电极探针将电极插入纵行肌纤维中，可选择DEMO或DL1或DL2肌纤维。注意不要穿透肌纤维。此时标本已准备就绪，可进行实验。采用吸吮电极刺激节段神经束，用玻璃微电极记录来自肌肉纤维的突触反应，触发移植物刺激器以每秒一次（1 Hz）的频率刺激神经，以获得时相性反应。接着，将电极置入SEL肌纤维中。SEL是一种紧张性肌肉。使用10赫兹的短脉冲串刺激神经以诱导强直性反应。比较DEL和SEL肌肉的记录反应。注意，时相性DEL肌肉的突触反应幅度大于强直性SEL肌肉。接下来的实验系列将重点研究螯虾的屈肌，而非伸肌。取一只新的螯虾，按照本手术示意图分离其腹部。在本视频的第一部分，将分离出的尾部标本置于盛有生理盐水的培养皿中，并用大头针固定尾部及标本的上部区域。请注意，在进行 Caro 实验时，为了保持紧张性屈肌的功能，必须保留腹侧神经索的完整性。使用解剖刀在标本腹侧两根肋骨之间的关节膜上开始做一个纵向切口。进行此切口时务必格外小心，避免切得过深，以防切断运动神经根，并确保浅层肌肉不受损伤。进行下一步操作。在显微镜下，使用剪刀或解剖刀从覆盖肌肉的薄层膜的纵切口处水平剪开。扩大切口以形成关节膜瓣，并将膜瓣向上抬起。使用剪刀剪除暴露浅层屈肌的瓣膜，以便对浅层屈肌进行细胞内记录。采用与记录腹肌伸肌静息膜电位和突触反应时相同的仪器和装置。同前，使用充满三摩尔氯化钾的细胞内电极。将电极插入浅层屈肌的肌纤维中，注意不要穿透肌肉。记录EPSP的自发活动。注意EPSP的不同幅度，并观察是否存在任何IPSP。取一把小号画笔，沿含有记录电极的同一节段的表皮边缘小心刷动。若观察到反应增强，注意兴奋性突触后电位（EPSP）频率或幅度的任何变化。这表明由于感觉神经放电改变，额外的运动神经元被募集参与反应。小心地将生理盐水浴液更换为含有神经调节物质的溶液，例如含一微摩尔浓度的5-羟色胺（血清素）的生理盐水，或用二氧化碳饱和的生理盐水。然后重复使用画笔进行刺激。注意更换浴液对所记录的神经活动造成的影响。将灌流液换回正常任氏液，观察肌纤维活动是否恢复至基线水平。该图显示的是在浅层屈肌肌纤维中记录到的兴奋性突触后电位（EPSP）。注意观察EPSP幅度的差异。本实验的下一阶段使用细胞外电极来监测运动神经元的动作电位，这些动作电位由感觉神经到中枢神经系统再到运动神经元回路中的活动所引发。首先制作一个吸吮电极以刺激感觉神经。将一段塑料管置于火焰上拉制。下一步是将导管修剪至所需尺寸。为此，您需要观察制备样本中的神经，以判断吸吮电极所需开口直径的大小。根据小龙虾的大小不同，神经束的直径可能从约一毫米到几毫米不等。剪切导管的拉伸部分，使尖端开口的尺寸恰好能够固定神经。如果开口过大，神经可能会脱落；如果开口过小，神经可能因电极的压力而受损。将塑料导管套在玻璃蔗糖电极的尖端。与细胞内记录设置相比，细胞外反应监测的电生理学和软件设置略有不同。按照 accompanying article 中指定的设备，将支配浅层屈肌的第三条神经通路吸入吸电极中。现在可以开始记录动作电位。该通路包含五个兴奋性运动神经元和一个抑制性运动神经元。记录完基础活动后，用毛刷刺激体壁以观察所产生的动作电位的变化。随后，将灌流液更换为神经调质（如血清素），操作同前一个实验，并记录反应的任何变化。附加练习见配套文本。本记录显示了在用毛刷刺激体壁前后，从第三条通路记录到的动作电位，请比较刷动前与刺激期间动作电位的频率。该记录显示了在正常盐水和5-羟色胺溶液中从第三条通路记录到的动作电位。将正常盐水中动作电位的频率与5-羟色胺中的频率进行比较，如刚才所示。刺激可使放电频率较基线水平升高。还证明了5-羟色胺可使放电频率较正常生理盐水条件下升高。该图显示，当刷拭刺激与5-羟色胺联合应用时，放电频率的增加更为显著。细胞外钾离子浓度对静息膜电位影响的实验结果与理论推导结果的比较，表明了离子对膜电位的影响作用。我们还向您展示了如何记录快相肌和张力肌神经肌肉接头处的神经递质反应。这些技术可用于探究性学生实验课程，以讲授基本概念和生理学知识。通过本实验操作所掌握的技术，可用于解答与其他实验制备相关的问题，以及与医学和健康相关的生理学应用问题。

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