生理实验与小龙虾肠:学生实验室的工作

本报告的总体目标是作为生理学课程中参与生理实验的高中高年级学生和本科生的教学工具。学生将学习如何暴露并记录小龙虾后肠的收缩活动。进一步的操作是将后肠从动物体内分离，以便直接施加化合物。

接下来，在施加各种药理学试剂以研究改变收缩强度的机制时，监测后肠平滑肌收缩的力度和节律。通过药理学检测和受体亚型分型，获得结果显示了调节剂作用于神经支配或直接作用于肌肉的效果。您好，我是布鲁克大学生物科学系的 Dr. J Mercier。

我一直在使用螯虾后肠作为研究控制内脏肌肉的神经递质的实验模型。我也将这一模型用作教学工具，并与肯塔基大学Robin Cooper博士的实验室合作，共同完善一系列由学生操作的实验，用于教学目的。该方法有助于深入了解螯虾后肠的功能。

它还可应用于涉及蠕动节律相关疾病的研究。也可用于描述肌肉调节及神经支配机制的基础原理。学生将通过使用药理学试剂、神经递质和神经激素来学习解读生理学和药理学数据，并获得关于受体功能的总体理解。

关于激动剂和拮抗剂，学生将构建剂量-反应曲线，并以图形形式呈现数据以进行统计分析。为麻醉动物，将一只体长为6至10厘米的螯虾置于冰上5至10分钟。用一只手从螯虾的螯后方固定住已麻醉的个体。迅速从两侧的眼窝处向头部中央切割，随后将螯虾去头。

制备过程中血液会具有黏性，因此操作完成后应及时清洗工具。接着，切除腿部和螯足，然后切除左右尾鳍，保留中间尾鳍，并沿腹部背侧切至最后一节。

然后沿最后一节段切开，并沿另一侧向下切开。取下背侧外壳。将解剖好的小龙虾放入铺有滤纸的培养皿中。

使用效果较差的螯虾生理盐水。用解剖针将标本固定在培养皿中以固定标本。后肠通常被大量血管和结缔组织所包围。

用镊子将其移除，注意不要损伤肠道。此时后肠已沿腹部可见。

将解剖好的螯虾标本置于生理盐水中静置约10分钟，使其从解剖和生理盐水暴露造成的休克中恢复。观察后肠缓慢的蠕动性收缩。此时可开始计算收缩频率。

记录30秒内发生的收缩次数，并记入日志。同时记录所发生收缩的类型，判断其为蠕动性还是痉挛性收缩。注意任何蠕动波的方向。

计数靠近肛门处以及腹部中段的收缩频率，观察这两个区域的频率是否存在差异。准备多种测试溶液，并使其温度与灌流盐溶液相同。此处首先测试的溶液为用螯虾盐溶液配制的1微摩尔血清素。

使用移液管将螯虾暴露腹部腔内的生理盐水移除，然后直接将1微摩尔的5-羟色胺溶液施加到后肠上。加入新溶液后立即等待30秒，随后在肛门附近区域记录接下来30秒内的收缩次数，再记录腹部中段区域接下来30秒内的收缩次数。将这些数值记录在表格中，并同时注明所发生的收缩类型。下一项。

将记录皿中的测试溶液倒出，用正常的螯虾生理盐水多次冲洗后肠。然后每30秒冲洗一次制备样本，持续五分钟。此时，可以加入下一种测试溶液，在本演示中为1微摩尔的Topamine。

按照之前的方法记录您的观察结果，并对剩余的待测化合物重复此过程。当使用同一物质的不同浓度时，务必从最低浓度开始，逐步进行至较高浓度。用于测量胃肠道收缩力的装置包括一台安装有 LabChart 7 软件的笔记本电脑、Bridge Pod、PowerLab 26T 以及力传感器。

在测量胃肠道肌肉收缩力之前，需要先分离胃肠道。为此，剪除腹部最后一节段的肌肉，将两枚或多枚大头针穿过肛门两侧柔软的腹侧表皮，然后剪去其余的腹部组织，仅保留后肠和肛门与一小块表皮相连。肠道的切断位置应靠近胸段与腹段的连接处。

现在将胃肠道移至底部铺有锡箔的浅皿中。胃肠道背侧有一条血管，需小心将其从胃肠道上分离。

将新鲜的螯虾生理盐水倒入制备样本中。将力传感器移至制备样本上方。仔细观察粘在力传感器底部的针脚。

连接肠道的一端带有一个小弯钩。将针的小弯钩端钩住后肠的切断端。钩住后肠后，轻轻移动培养皿，直至后肠拉直绷紧。

进行此步骤时需小心，肠道应保持紧绷，但不可过紧。过紧可能会损伤肌肉。当培养皿处于最佳位置时，使用石蜡或黏土固定培养皿以保持稳定。

接下来，启动软件。开始记录前，打开实验室图表软件。关闭实验室图表和欢迎中心。

转到左上角的设置。点击左下角的通道设置。将通道设置更改为仅保留一个通道。

点击屏幕右侧的“确定”。进入通道一的桥接舱。将量程设置为最敏感的档位，即右上角图表顶部的 200 微伏。

将每秒循环次数设置为2K。现在可以开始记录。点击“开始”以确保设备正常工作。

用移液器轻轻触碰换能器尖端。此时应观察到软件记录的力值发生变化。点击软件中的“停止”，然后点击“开始”并让程序继续运行。

持续约20秒，点击停止并添加标记为生理盐水的注释。仅通过测量一次偏转开始到下一次偏转开始之间的时间，或通过计算一分钟或两分钟内的总偏转次数，来计算收缩频率。根据收缩发生的快慢，以每分钟收缩次数或每秒收缩次数为单位计算频率。

为了测量收缩力，使用相对测量值来比较保存文件中不同条件下的收缩情况。将标记 M 移动到基线位置，然后将光标移至偏转波形的峰值处，并记录屏幕右上角显示的数值。该数值为 delta 值，表示从 M 点到峰值的差值。

请注意，必须将光标固定在峰顶以测量变化。然后移动 M 标记和光标至下一个感兴趣的波形，并重复测量以考察调节剂的作用。在此制备过程中，缓慢更换灌流液为测试溶液。

在此情况下，加入一微摩尔的5-羟色胺，并继续记录收缩频率和收缩力，作为最后一次测试。通过该实验准备，检测缝隙连接抑制剂是否改变收缩频率或收缩力，缝隙连接抑制剂包括己醇或经二氧化碳鼓泡的生理盐水。这些化合物最后使用，因为长时间暴露可能损伤肌肉纤维。为比较各种化合物的作用效果，将数据绘制成图表。

该制备方法的另一个有趣用途是记录环形肌产生的张力。然而，如果你已在制备过程中应用了缝隙连接抑制剂，则这些抑制剂可能已损伤环形肌；在此情况下，应使用新鲜的后肠制备样本以检测环形肌功能。为暴露环形肌，需使用精细剪刀沿肠管的纵轴方向剪开肠壁。

使用细针将条带的一侧牢固地固定在培养皿上。将换能器上的带钩针连接到条带的另一侧。对制备的标本施加与纵向肌相同的测试化合物，所测试化合物与收缩次数及类型之间的关系如图所示。

可以绘制生理盐水、5-羟色胺和谷氨酸溶液中收缩次数随时间变化的曲线图。还可以绘制生理盐水、5-羟色胺和谷氨酸溶液中收缩次数与收缩力度（以毫伏为单位）的关系图。这些作图可分别针对纵行肌和环形肌进行，以检测肠道不同区域的纵行肌和环形肌对各种调节因子的反应是否存在差异。

上述实验可在从肛门向上至腹部的不同区域重复进行。在进行该操作时，需注意使用镊子时应小心，避免损伤胃肠道，同时使用力传感器时不可过度牵拉。完成该操作后，还可进行其他方法，如肌肉的电生理记录，以研究其他问题，例如离子通道的功能与调节，并可作为其他动物模型中其他组织的参考模型。