Name: 生理实验与小龙虾肠:学生实验室的工作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学习小龙虾后肠生理实验技术，包括解剖分离、力传感器记录平滑肌收缩及药物调控机制。该方法适用于神经生理学与药理学教学，帮助学生掌握受体功能与剂量反应曲线分析。

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由肯塔基大学生物学系、本科教育办公室及文理学院提供支持。

1. 引言

最近对 crayfish 后肠的全面综述来自 Barbara E. Musolf 博士的学位论文（2007，美国佐治亚州亚特兰大市，佐治亚州立大学），该研究主要关注5-羟色胺能调节与神经支配（Musolf 等，2009）。甲壳动物后肠最早由比较解剖学先驱Alexandrowicz在100多年前进行研究（Alexandrowicz，1909），他描述了后肠神经支配的各个方面。此后多年研究不断深入，明确了肌肉层类型与组织结构，探讨了后肠在整体动物渗透调节中的功能，并研究了多种化合物对后肠收缩性的调节控制（参见Musolf，2007年的综述）。值得注意的是，后肠的肛门部分不仅具有排出粪便的功能，还能从环境中吸收水分以实现渗透调节。根据动物的需求，该肠段可发生正向或逆向的蠕动。

Alexandrowicz（1909年）鉴定出两种支配甲壳类动物后肠的神经丛，即内神经丛和外神经丛，这两种神经丛后来被证明是鉴定和表征神经递质的丰富来源。20世纪50年代，Ernst Florey博士开始对螯虾后肠进行一系列药理学研究，证明乙酰胆碱及其相关化合物以及肾上腺素和去甲肾上腺素均可调节后肠收缩（Florey，1954）。Florey是被称为“抑制因子I（Factor-I）”的抑制性物质的发现者，他研究了该物质对多种组织标本的作用，包括螯虾的消化道系统（Florey，1961）。后来证实，抑制因子I即为γ-氨基丁酸（GABA）。因此，螯虾后肠在突触抑制的早期研究中发挥了重要作用。

在发现GABA之后，其他一些假定的神经递质也被证实与后肠神经丛相关，并能引发生理反应。这些神经递质包括多巴胺（Elekes et al. 1988；Elofsson et al. 1968）、促直肠肽（proctolin，RYLPG-OH；Mercier et al. 1997）、两种 orcokinin 肽（NFDEIDRSGFGFN 和 AFDEIDRSGFGFN；Bungart et al. 1994；Dircksen et al. 2000）、促肌收缩神经肽（orcomyotropin，FDAFTTGFamide；Dircksen et al. 2000）以及一种肌抑制肽（myosuppressin peptide；Mercier et al. 1997；最可能为 pQDLDHVFLRFamide，参见 Stemmler et al. 2007）。这些物质均可调节后肠的自发性收缩活动，除GABA外，其余均表现为兴奋性作用。后肠对谷氨酸和红藻氨酸（quisqualate）也有反应（Jones, 1962；Wrong et al. 2003），但尚未有明确证据表明存在谷氨酸能神经支配。介导这些不同神经递质作用的细胞内信使机制在很大程度上仍未被探索，但已有研究表明cAMP参与了多巴胺增强收缩的作用（Knotz &amp; Mercier, 1995）。
尽管甲壳动物后肠在去神经后仍能自发收缩，但这类收缩通常较弱且无规律（Wales, 1982; Winlow） &amp; Laverack，1972a）。节律性蠕动运动需要中枢神经系统发出协调的运动输出，该输出似乎起源于腹部最后一对神经节（Winlow）。 &amp; Laverack, 1972a, b, c)。在小龙虾中，运动输出通过第7条神经传递至后肠th 腹部神经根，其中包含75条轴突，其胞体位于最后一对腹神经节内（Kondoh） &amp; Hisada, 1986)。至少部分肽类似乎由源自最后一对腹神经节的神经元供应至后肠神经丛（Dircksen 等 2000；Mercier 等 1991b；Siwicki &amp; Bishop, 1986），但多巴胺由更靠前的神经节中的神经元提供（Mercier 等 1991a)。由于通过7的运动输出th 腹部神经根对于产生大范围的协调性收缩是必需的，因此上述列出的某些或全部假定递质可能在某种程度上参与了蠕动过程。然而，它们各自的贡献尚不明确。通过分别研究这些递质对环形肌和纵行肌的作用，或许可以获得一些认识（Mercier &amp; Lee, 2002)

除了调控未消化食物的移动外，与甲壳动物后肠相关的神经丛似乎还具有与蜕皮相关的重要内分泌功能。蟹类Carcinus maenas的后肠含有内分泌细胞，可在蜕皮期（ecdysis）释放甲壳动物高血糖激素及其相关的前体肽（Webster et al. 2000），提示其在蜕皮过程中参与水分吸收和组织膨胀。因此，甲壳动物的后肠参与了多种重要的生理过程。

本报告主要作为生理学课程中参与实验的高中高年级学生和本科生的教学工具。学生可通过本实验探讨昆虫后肠收缩及其功能的意义及潜在机制。实验将使用药理学试剂、神经递质和神经激素，并绘制剂量-反应曲线，使学生掌握生理学和药理学数据的获取与解读方法。学生还可由此获得关于受体功能（包括激动剂与拮抗剂）的基本理解。此外，学生将学习如何以图形形式呈现数据，以便进行统计分析。

从螯虾后肠分离并记录其收缩活动非常简便。在离体标本中，肠道易于暴露于外源性物质。节律性蠕动活动的变化可通过肉眼观察或使用测力换能器进行监测，后者还可记录收缩力的大小。由于该生物测定标本操作简单且结果可靠，螯虾后肠至今仍广泛用于研究蠕动机制、运动输出调节、肌肉收缩以及受体功能等多个科学问题。此外，后肠也适用于检测杀虫剂、杀甲壳动物剂及污染物的作用机制。


2. 方法
2.1）材料
<ul>
<li>小龙虾</li>
<li>小龙虾生理盐水</li>
<li>解剖器械（粗剪刀和细剪刀、粗镊子和细镊子）</li>
<li>硅胶底培养皿</li>
<li>不锈钢解剖针</li>
<li>烧杯（用于盛放化学溶液）</li>
<li>封口膜（用于覆盖和混合溶液）</li>
</ul>
2.2）解剖
<ol>
<li>将体长为 6-10 cm 的克氏原螯虾（Procambarus clarkii）置于冰上 5 至 10 分钟，以麻醉动物，随后开始解剖。</li>
<li>用一只手握住麻醉后的克氏原螯虾，位置位于螯足后方。迅速从眼窝处向头部中央沿两侧剪开，然后将头切除（注意：标本血液干燥后会变黏，操作完成后应及时清洗工具）。 
<img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig1.jpg" alt="龙虾解剖步骤；解剖学研究；实验课操作；剪刀，外骨骼探索。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：克氏原螯虾去头操作</li>
<li>切除螯足和步足。</li>
<li>切除左右尾鳍，仅保留中央尾鳍（尾附肢）。</li>
<li>在克氏原螯虾背侧，沿背甲左右两侧向腹侧剪开。 
<img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig2.jpg" alt="甲壳类解剖，突出尾部分节结构；手术工具使用中。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：去除背甲</li>
<li>在背甲背侧做横向剪切，注意切口应浅，以防损伤胃肠道（G.I.）。随后移除腹部背侧甲壳的下部。</li>
<li>将已解剖的克氏原螯虾放入涂有 Sylgard 的培养皿中。</li>
<li>用大头针将克氏原螯虾固定在尾鳍尖端处。根据需要，可在胃肠道两侧使用更多大头针将身体固定。</li>
<li>向培养皿中加入克氏原螯虾生理盐水，使盐水覆盖胃肠道。务必持续使用移液器向胃肠道滴加生理盐水。生理盐水为改良的 Van Harreveld 溶液（1936），其成分为：205 mM NaCl；5.3 mM KCl；13.5 mM CaCl2·2H2O；2.45 mM MgCl2·6H2O；5 mM HEPES，并调节至 pH 7.4。解剖后的克氏原螯虾应如图 3 所示。 
<img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig3.jpg" alt="解剖昆虫腹部，显微镜图像，解剖学研究，标本分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：胃肠道完整的解剖克氏原螯虾</li>
</ol>
2.3）实验

2.3.1) 动物体内的收缩反应
<ol>
<li>准备好待测化合物的溶液，并使其温度与灌流任氏液相同。可使用分别配制的5-羟色胺（100 nM，1 µM）、谷氨酸（1 µM）和多巴胺（1 µM）溶液（溶于螯虾任氏液）作为初始待测物质。</li>
<li>将解剖好的螯虾置于螯虾任氏液中静置约10分钟，使其适应解剖操作及任氏液暴露带来的刺激。此时后肠应开始出现缓慢的蠕动性收缩。</li>
<li>一旦收缩开始，记录30秒内发生的收缩次数（注意记录收缩类型：例如蠕动型或痉挛型，以及任何蠕动波的传播方向）。 
表1：螯虾任氏液中的收缩情况 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>收缩次数</td>
 <td>收缩类型</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table></li>
<li>使用移液器吸除螯虾暴露腹腔内的任氏液，直接将含有待测物质的任氏液滴加至后肠表面。</li>
<li>添加溶液后立即开始记录，统计30秒内发生的收缩次数，并记录收缩类型（例如蠕动型或痉挛型）。 
表2：暴露于不同化合物后的收缩情况 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>待测化合物</td>
 <td>浓度</td>
 <td>收缩次数</td>
 <td>收缩类型</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table></li>
<li>记录完待测物质的反应后，立即用正常的螯虾任氏液对胃肠道进行多次冲洗。冲洗间隔约为30秒一次，持续静置5分钟。</li>
<li>使用移液器将下一种待测化合物溶液或前一种物质的不同浓度溶液直接施加到后肠表面。建议从较低浓度开始，逐步提高浓度。</li>
<li>每次添加新的物质或新的浓度后，立即记录30秒内的收缩次数，并注明收缩类型。</li>
</ol>
2.3.2）记录离体标本的收缩力
<img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig4.jpg" alt="使用力传感器、PowerLab 26T 和 LabChart7 分析的静态平衡实验装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：装置
<ol>
<li>将换能器连接到桥式探头。</li>
<li>将桥式探头连接到 PowerLab 26T。</li>
<li>将 PowerLab 26T 连接到计算机的 USB 接口。</li>
<li>通过单击桌面上的 labchart7 图标打开 LabChart7。
<ul>
<li>LabChart 欢迎中心窗口将弹出，将其关闭。</li>
<li>单击“Setup”（设置）。</li>
<li>单击“Channel Settings”（通道设置），将通道数更改为 1（位于窗口左下角），然后点击“OK”。</li>
<li>在图表左上角，将每秒周期数设置为约 2k，将电压（y 轴）设置为约 500 或 200 mV。</li>
<li>单击图表右侧的“Channel 1”（通道 1），然后单击“Input Amplifier”（输入放大器）。确保选中以下设置：单端输入（single-ended）、交流耦合（ac coupled）、反相（invert，根据需要反转信号）以及抗混叠（anti-alias）。</li>
<li>开始记录时，点击“Start”（开始）。</li>
</ul></li>
<li>取出标本，在胸部与腹部交界处切断消化道。然后小心地围绕尾部尾节部分进行切割。将消化道从解剖好的螯虾体内取出，并放入 Sylgard 培养皿中。消化道背侧有一条血管，需小心将其从消化道上剥离。向标本中加入新鲜的螯虾生理盐水。</li>
<li>将力换能器安装在靠近解剖标本的夹具上。</li>
<li>如图 5 所示，将力换能器的钩子连接到螯虾消化道上。 
<img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig5.jpg" alt="晶体生长的光学浮区法，展示熔体表面张力控制技术。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5： 浸于生理盐水中的离体螯虾后肠，连接至力换能器的钩子</li>
<li>等待消化道开始收缩，然后在 LabChart7 上点击“Start”（开始）。</li>
<li>运行程序约 20 秒后，点击“Stop”（停止），并在图表文件中添加注释，标注为“仅生理盐水”。填写表 4。 
表 4：含目标化合物时的收缩情况 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>收缩次数</td>
 <td>收缩幅度（mV）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table></li>
<li>加入待测的目标化合物，并立即在 LabChart7 上点击“Start”（开始）。</li>
<li>运行程序约 20 秒后，点击“Stop”（停止），并在图表文件中直接添加注释，注明所加物质及其浓度。填写下表。 
表 5：含_________化合物时的收缩情况 
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>收缩次数</td>
 <td>收缩幅度（mV）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table></li>
<li>使用移液器以螯虾生理盐水冲洗标本。</li>
<li>以类似方式加入其他物质或不同浓度的溶液，并立即在 LabChart7 上点击“Start”（开始）。</li>
<li>运行程序约 20 秒后，点击“Stop”（停止），并在图表文件中直接添加注释和标签，标明所用化合物及其浓度。</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
<li>根据实验 2.3.1，绘制每种溶液（生理盐水、5-羟色胺、谷氨酸）的收缩次数随时间变化的曲线图。解释任何趋势。</li>
<li>根据实验 2.3.2，绘制每种溶液（生理盐水、5-羟色胺、谷氨酸）的收缩次数与收缩幅度（mV）的关系图。解释任何趋势。</li>
</ol>
3.1 ) 测定收缩的速率和力度
可通过测量一次偏转开始到下一次偏转开始的时间，或统计一至两分钟内的总偏转次数，来计算收缩频率。然后可根据收缩发生的快慢，将数值表示为每分钟或每秒的收缩次数。
为了量化收缩力，可采用相对测量值来比较不同条件下的情况。在已保存的文件中，可使用标记“M”并将其移至基线处，然后使用光标移至偏转波形的峰值，并记录屏幕右上角显示的差值（即从M到峰值的差值）。注意在测量变化值时需保持光标静止不动。随后将标记“M”移至下一个感兴趣的波形，重复上述测量步骤。

<ol><li>Alexandrowicz, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zur+Kenntnis+des+sympathischen+Nervensystems+der+Crustaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Jena+Z.+Naturw%22%5BJournal%5D)">Zur Kenntnis des sympathischen Nervensystems der Crustaceae.</a> Jena Z. Naturw. 45, 395-444 (1909).</li>
<li>Bungart, D., Dircksen, H., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+and+distribution+of+the+myotropic+neuropeptide+orcokinin+in+the+nervous+system+of+astacidean+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination and distribution of the myotropic neuropeptide orcokinin in the nervous system of astacidean crustaceans.</a> Peptides. 15, 393-400 (1994).</li>
<li>Dircksen, H., Burdzik, S., Sauter, A., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+orcokinins+and+the+novel+octapeptide+orcomyotropin+in+the+hindgut+of+the+crayfish+Orconectes+limosus%3A+identified+myostimulatory+neuropeptides+originating+totether+in+neurons+of+the+terminal+abdominal+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two orcokinins and the novel octapeptide orcomyotropin in the hindgut of the crayfish Orconectes limosus: identified myostimulatory neuropeptides originating totether in neurons of the terminal abdominal ganglion.</a> J. Exp. Biol. 203, 2807-2818 (2000).</li>
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<li>Elofsson, R., Kauri, T., Nielsen, S. O., Stroemberg, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholamine-containing+nerve+fibres+in+the+hindgut+of+the+crayfish+Astacus+astacus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Experentia%22%5BJournal%5D)">Catecholamine-containing nerve fibres in the hindgut of the crayfish Astacus astacus L.</a> Experentia. 24, 1159-1160 (1968).</li>
<li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uber+die+wirkung+von+acetylcholin%2C+adrenalin%2C+nor-adrenalin%2C+faktor+I+und+anderen+substanzen+auf+den+isolierten+enddarm+des+flusskrebses+Cambarus+clarkii+Girard%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Vergl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Uber die wirkung von acetylcholin, adrenalin, nor-adrenalin, faktor I und anderen substanzen auf den isolierten enddarm des flusskrebses Cambarus clarkii Girard.</a> Z. Vergl. Physiol. 36, 1-8 (1954).</li>
<li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+test+preparation+for+bio-assay+of+Factor+I+and+gamma-aminobutyric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A new test preparation for bio-assay of Factor I and gamma-aminobutyric acid.</a> J. Physiol. 156, 1-7 (1961).</li>
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<li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+%28L.%29.+2.+Motor+output%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 2. Motor output.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 29-47 (1972).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

相关视频和文本中提供的细节描述了记录小龙虾后肠活动所需的关键步骤 原位 以及 体外本报告的一个目标是提高人们对这种制备方法在学生自主开展的实验教学实验室中潜力的认识，以帮助讲授生理学和药理学中的基本概念。

这些制备方法可用于研究多个实验问题，有助于更深入地理解后肠的生理功能。目前，尚不清楚调控蠕动波及其逆转的机制。对于整个胃肠道的高级调控机制也尚未完全阐明。高级中枢如何将其活动与直接控制胃肠道系统的自主神经输出相整合，仍是待探索的研究领域（Shuranova et al., 2006）。此外，甲壳动物后肠的渗透调节能力，以及在蜕皮和环境应激过程中渗透调节的功能，尚未被充分阐明。这一实验体系中仍有许多问题有待解答。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt;小龙虾（&lt;em&gt;Procambarus clarkii&lt;/em&gt;），购自美国路易斯安那州拉塞尔县阿查法拉亚生物供应公司（Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA）。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;标准小龙虾生理盐水：改良自Van Harreveld溶液（1936年）。（单位为 mM）205 NaCl；5.3 KCl；13.5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；2.45 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；5 HEPES，调节pH至7.4。血清素、谷氨酸和多巴胺均用小龙虾生理盐水配制。所有化学试剂均购自Sigma化学公司（St. Louis, MO）。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;解剖工具：精细#5镊子、精细剪刀、刀片夹持器、#26002-20昆虫针（均购自Fine Science Tools (USA), Inc.，地址：373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139）。&lt;/li&gt; &lt;li&gt;底部涂有Sylgard的培养皿&lt;/li&gt; &lt;li&gt;烧杯（用于盛放化学溶液）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;电信号通过&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML856/&quot; target=&quot;_blank">PowerLab 26T&lt;/a&gt;接口实时记录到计算机中（&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com&quot; target=&quot;_blank">ADInstruments&lt;/a&gt;，美国科罗拉多斯普林斯）。我们使用ADInstruments公司提供的标准软件Chart或Scope。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/Signal_Conditioners/Blood_Pressure,_Force,_Displacement/&quot; target=&quot;_blank">桥式放大器模块（Bridge pod）&lt;/a&gt;，用于连接力传感器（不同类型的力传感器需使用不同的Bridge pod）。&lt;/li&gt; &lt;li&gt; &lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0402/&quot; target=&quot;_blank">MLT0402（2克）力传感器&lt;/a&gt;为视频中所示的研究级传感器。&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/mlt0210d#overview&quot; target=&quot;_blank">MLT 0210/D（10 mg–25克）&lt;/a&gt;和&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/products/MLTF500ST#overview&quot; target=&quot;_blank">MLT 500/A（0–500克）&lt;/a&gt;为教学级传感器（&lt;a href=&quot;http://www.adinstruments.com/&quot; target=&quot;_blank">ADInstruments&lt;/a&gt;）。&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

使用螯虾后肠进行生理学实验：一项学生实验室练习

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

本报告旨在介绍用于制备螯虾后肠的解剖技术，并演示如何使用力传感器进行生理记录，以监测收缩强度。此外，我们还展示了如何直观地监测蠕动活动，该方法可作为多种肽类、生物源性胺类和神经递质的生物测定手段。该实验体系适用于生理学教学实验，也适合向学生演示药理学概念。该制备方法已应用逾百年，至今仍是一个理想的模型，可用于研究蠕动节律的产生与调控机制，以及揭示其调节过程的内在机理。50多年前始于后肠的药理学检测和受体亚型分类研究，至今仍为相关科研提供重要贡献。这一稳定可靠的实验体系非常适用于生理学与药理学领域学生的教学培训。

在本报告中，我们展示了可用于研究小龙虾后肠生物学的技术。我们演示了如何解剖小龙虾腹部，并研究其相关的解剖结构、生理特性以及活动的调控机制。通过使用力传感器来测量节律性蠕动活动及收缩强度。

本报告旨在介绍制备小龙虾后肠的解剖技术，并演示如何进行生理记录……

本报告的总体目标是作为生理学课程中参与生理实验的高中高年级学生和本科生的教学工具。学生将学习如何暴露并记录小龙虾后肠的收缩活动。进一步的操作是将后肠从动物体内分离出来，以便直接施加化合物。接下来，在施加各种药理学试剂以研究改变收缩强度的机制时，监测后肠平滑肌收缩的力度和节律。通过药理学检测和受体亚型分型，获得结果显示了调节剂作用于神经支配或直接作用于肌肉的效果。您好，我是布鲁克大学生物科学系的 Dr. J Mercier。我一直在使用螯虾后肠作为研究控制内脏肌肉的神经递质的实验模型。我也将该模型用作教学工具，并与肯塔基大学Robin Cooper博士的实验室合作，共同优化一系列由学生操作的实验，用于教学目的。该方法有助于深入了解螯虾后肠的功能。它还可应用于涉及蠕动节律相关疾病的研究。也可用于描述肌肉调节及神经支配机制的基础原理。学生将通过使用药理学试剂、神经递质和神经激素来学习解读生理学和药理学数据，并获得关于受体功能的总体理解。关于激动剂和拮抗剂，学生将构建剂量-反应曲线，并以图形形式呈现数据以进行统计分析。为麻醉动物，将一只体长为6至10厘米的螯虾置于冰上5至10分钟。用一只手从螯的后方握住已麻醉的螯虾。迅速从两侧的眼窝向头部中央切割，然后将螯虾去头。制备过程中血液会具有黏性，因此操作完成后应及时清洗工具。接下来，切除腿部和螯足，然后切除左右尾鳍，保留中间尾鳍，并沿腹部背侧一直切至最后一节。然后沿最后一节段切开，并沿另一侧向下切开，取下背壳。将解剖好的小龙虾放入铺有锡纸的培养皿中。使用效果较差的螯虾生理盐水。用解剖针将制备好的标本固定在培养皿中以固定标本。后肠通常被大量血管和结缔组织包围。用镊子将其移除，注意不要损伤肠道。此时后肠已沿腹部清晰可见。将解剖好的螯虾标本置于生理盐水中静置约10分钟，使其从解剖和生理盐水暴露造成的休克中恢复。观察后肠缓慢的蠕动性收缩。随后即可开始计算收缩频率。记录30秒内发生的收缩次数，并将其记入日志。同时记录发生的收缩类型，以及其为蠕动性还是痉挛性收缩。注意任何蠕动波的传播方向。计数靠近肛门处以及腹部中段的收缩频率，观察这两个区域之间是否存在频率差异。准备多种测试溶液，并将其温度调节至与灌流生理盐水相同。此处首先测试的溶液为用螯虾生理盐水配制的1微摩尔血清素溶液。使用移液器将螯虾暴露腹部体腔内的生理盐水吸除，并直接将1 µM的5-羟色胺溶液施加到后肠。加入新溶液后立即等待30秒，然后计数肛门附近区域30秒内的收缩次数，接着计数腹部中段接下来30秒内的收缩次数。将这些数值记录在表格中，并同时记录所发生的收缩类型。下一步。将记录皿中的测试溶液倒出，用正常的螯虾生理盐水冲洗后肠数次。随后每30秒冲洗一次制备样本，持续五分钟。此时，可加入下一种测试溶液，本演示中为1微摩尔的Topamine。按照之前的方法记录您的观察结果，并对剩余的待测化合物重复此过程。当使用同一物质的不同浓度时，务必从最低浓度开始，逐步进行至较高浓度。用于测量胃肠道收缩力的装置包括一台安装有 LabChart 7 软件的笔记本电脑、Bridge Pod、PowerLab 26T 以及力传感器。在测量胃肠道肌肉收缩力之前，需要先分离胃肠道。为此，剪除腹部最后一节的肌肉，将两枚或更多的针穿过肛门两侧柔软的腹侧表皮，然后切除其余的腹部组织，仅保留后肠和肛门连接一小块表皮。肠道的切断位置应靠近胸部与腹部的交界处。现在将胃肠道移至底部涂有沙丁鱼油的浅皿中。胃肠道背侧有一条血管，需小心将其从胃肠道上剥离。将新鲜的螯虾生理盐水倒入标本中。移动力传感器至标本处。仔细观察粘在力传感器底部的针。连接肠道的一端带有一个小弯钩。将针的小弯钩勾住后肠的切断端。勾住后肠后，轻轻移动培养皿，直至后肠绷紧。进行此步骤时需小心，肠道应保持紧绷，但不可过紧。过紧可能会损伤肌肉。当培养皿处于最佳位置时，使用石蜡或黏土固定培养皿以保持稳定。接下来，启动软件。开始记录前，请打开实验室图表软件。关闭实验室图表和欢迎中心。前往左上角的设置。点击左下角的通道设置。将通道设置更改为仅保留一个通道。点击屏幕右侧的“确定”。进入通道一的桥接舱。将量程设置为最敏感的档位，即右上角图表顶部的 200 微伏。将每秒循环次数设置为2K。现在可以开始记录。点击“开始”以确保设备正常工作。用移液器轻轻触碰换能器的探头。你应该能看到软件记录到的力值发生变化。在软件中点击停止，然后点击开始，让程序继续运行。持续约20秒，点击停止并添加一个标记为生理盐水的注释。仅通过测量一次偏转开始到下一次偏转开始之间的时间，或通过计算一分钟或两分钟内的总偏转次数，来计算收缩频率。根据收缩发生的快慢，以每分钟收缩次数或每秒收缩次数为单位计算频率。为了测量收缩力，使用相对测量方法在已保存的文件上比较不同条件下的收缩情况。将标记 M 移动到基线，然后将光标移至偏转波形的峰值处，并记录屏幕右上角显示的数值。该数值为 delta 值，表示从 M 点到峰值的差值。请注意，必须将光标固定在波峰处以测量其变化。然后将 M 标记和光标移至下一个感兴趣的波形，并重复测量以观察调节剂的作用。在此制备过程中，缓慢将灌流液切换为待测溶液。在此情况下，加入一微摩尔的5-羟色胺，并继续记录收缩频率和收缩力度，作为最后一次测试。通过该实验准备，检测缝隙连接抑制剂是否改变收缩的频率或力度，缝隙连接抑制剂包括己醇或经二氧化碳鼓泡的生理盐水。这些化合物应在最后使用，因为长时间暴露可能损伤肌纤维。为比较各种化合物的作用效果，将数据绘制成图表。该制备方法的另一个有趣用途是记录环形肌产生的力。然而，如果你已在制备过程中应用了缝隙连接抑制剂，则这些抑制剂可能已损伤环形肌；在此情况下，应使用新鲜的后肠制备样本以检测环形肌功能。为暴露环形肌，需使用精细剪刀沿肠管的纵轴方向剪开肠壁。使用细针将条带的一侧牢固地固定在培养皿上。将换能器上的带钩针连接到条带的另一侧。对制备的标本施加与纵向肌实验中相同的化合物，此处显示了所测试化合物与收缩次数及类型之间的关系。可以绘制生理盐水、5-羟色胺和谷氨酸溶液中收缩次数随时间变化的曲线图。还可以绘制生理盐水、5-羟色胺和谷氨酸溶液中收缩次数与收缩力度（以毫伏为单位）的关系图。这些作图可分别针对纵行肌和环形肌进行，以检测肠道不同区域的纵行肌和环形肌对各种调节因子的反应是否存在差异。上述实验可在从肛门向上沿腹部的不同区域重复进行。在进行该操作时，需注意使用镊子时应小心谨慎，避免损伤胃肠道，并注意使用力传感器时不要施加过大的拉力。在此操作之后，还可采用其他方法，如对肌肉进行电生理记录，以研究其他问题，例如离子通道的功能与调控，并可作为其他动物模型中其他组织的研究模型。

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