Name: 生产 C。线虫 galK选择标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 了解利用重组工程与galK选择标记在秀丽隐杆线虫中生产转基因的方法。该技术保留天然调控元件，通过SMID文库克隆基因组DNA实现高效基因修饰。

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作者感谢Lindsey Nash在技术开发过程中提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AG028977（A.L.F.）、匹兹堡大学老年独立研究中心（OAIC，AG024827）的试点项目资助以及匹兹堡大学的启动资金支持。

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未声明任何利益冲突。

利用fosmid构建转基因可保留所有天然的启动子元件、剪接变体以及3'非翻译区（UTR）调控元件，从而获得更接近天然表达模式的转基因，或在其他方法失败时成功构建功能性转基因5。所获得的转基因可携带多种表位标签，包括GFP或TAP标签。
转基因的构建包含三个步骤，全部在SW106细菌菌株中进行15。第一步，通过重组工程将galK基因整合到待修饰的fosmid中特定目标位点，所用的PCR产物在其两侧带有与目标fosmid互补的同源臂，并在中间携带galK。我们开发的一项改进是，在galK盒中同时整合了用于FLAG-GFP或TAP标签的同源区域，使得同一对寡核苷酸可用于fosmid修饰的第一步和第二步，从而降低了寡核苷酸的合成成本。另一项进一步简化是使用基于R6K的载体，该载体无法在SW106细菌菌株中复制，因此无需对亲本载体进行酶切消化。第二步，用GFP或TAP等标签替换galK盒，从而将标签与fosmid上的目标基因融合。此步骤具有很高的可靠性，通常可获得大量正确修饰...

<table><tbody><tr><td>FosmidMAX试剂盒</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>MOPS培养基</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>0.132 M 磷酸钾溶液</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-半乳糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-脱氧半乳糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>麦康凯琼脂基础</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>阿拉伯糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bacto琼脂</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

利用带有galk可筛选标记的重组工程法构建秀丽隐杆线虫（c. elegans）转基因

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

转基因动物的制备在科学研究中被广泛应用 秀丽隐杆线虫 研究包括利用GFP融合蛋白来分析目的基因的调控机制和表达模式，或构建特定基因的串联亲和纯化（TAP）标签版本以促进其纯化。通常通过将启动子置于GFP报告基因或目的cDNA的上游来构建转基因，这种方法往往能够产生具有代表性的表达模式。然而，该方法可能遗漏基因调控中的关键元件，例如3'非翻译区中的调控序列或可变启动子。此外，通常仅能通过此方法研究一种剪接变体。相比之下，使用由fosmid DNA克隆携带的线虫基因组DNA，很可能包含了大部分甚至全部参与基因调控的元件。 体内 从而能够更准确地捕获真实的表达模式和表达时序。为促进利用fosmid DNA构建转基因，我们描述了一种 E. coli 基于重组工程的方法，将GFP、TAP标签或其他目的序列插入基因组任意位置。该方法利用了 galK 基因作为重组工程中正向和负向筛选步骤的筛选标记，从而以高效率获得所需的修饰。此外，含有该基因的质粒 galK 基因两侧带有同源臂，可与常用的GFP和TAP融合基因连接，从而在构建GFP或TAP融合蛋白时使引物成本降低50%。这些质粒采用R6K复制起点，避免了对PCR产物进行繁琐的纯化步骤。最后，我们还展示了一种将目标序列整合到 unc-119 将标记插入到fosmid载体骨架中，使得该fosmid可直接注射或轰击进入线虫，以产生转基因动物。本视频演示了利用重组工程方法构建转基因的详细操作步骤。

利用由fosmid携带的基因组DNA为Caenorhabditis elegans构建转基因，具有显著优势，因为可保留全部天然调控元件。本文描述了一种基于galK可筛选标记、通过重组工程构建转基因的简单且稳健的实验流程。

利用带有galK可筛选标记的重组工程法构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）转基因

转基因动物的制备在秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究中被广泛应用，包括利用GFP融合蛋白来研究基因表达调控及……

以下实验的总体目标是利用携带在线虫基因组DNA的SMID文库克隆来生成转基因片段。使用基因组DNA可保留所有天然调控元件，例如位于3'非翻译区（UTR）的增强子。该目标通过将FO smid转移至SW106大肠杆菌（E. coli）菌株中，以利用可诱导的λ Red同源重组系统来实现。第二步，将 GAL K 基因插入 FO 质粒中的目标位置，以标记 GFP 或 tap 标签将要插入的位点。接着，通过同源重组将 Gade 基因替换为 GFP 或 tap TAC 标签，随后使用脱氧半乳糖进行负筛选，从而构建出修饰后的转基因序列。实验结果表明，通过菌落 PCR 验证 T 插入的成功，这些转基因序列能够被快速且成功地构建。大家好，我叫Love Ship，我在匹兹堡大学的Fisher实验室工作。今天我将演示一种用于构建秀丽隐杆线虫转基因的实验技术。为何选择以GK作为可筛选标记进行重组。与现有的创建Cogan转基因方法相比，该技术的主要优势在于，我们使用了目的基因的基因组DNA，因此能够涵盖基因调控中的所有关键元件，例如三端非翻译区（3' UTR）中的调控元件、可变剪接转录本、替代性启动子以及远端增强子，而这些元件在传统的基于标准克隆的方法中往往会被遗漏。接下来，让我们开始操作。根据 Worm Base 提供的信息，从基因服务公司订购目的基因（GOI）的 FO smid 克隆。在选择克隆时，我们优先选择目的基因位于序列中央的克隆。若克隆不包含邻近基因则更理想，但此类克隆可能较难获得培养物。将含有12.5 微克/毫升氯霉素的LB培养基中的GOI的SMID克隆在EPI 300菌株中培养，并在37摄氏度下生长。接下来，在37摄氏度下培养1.5 毫升SMID过夜培养物，并进行质粒小提以获得SMID DNA。使用Epicenter SMID提取试剂盒时，我们遵循说明书中的替代方案，该方案涉及在较早步骤中加入Ribo shorter混合液，同时在此前测定FOSS DNA浓度。使用分光光度计测定，其值通常很低但已足够。为成功进行电穿孔，需制备电转化感受态SW106细胞：在14毫升带盖试管中，于LB培养基中32摄氏度条件下培养5毫升过夜培养物。次日早晨，将1毫升培养物接种到装有100毫升LB培养基的2升烧瓶中。将SW106菌株培养至OD600为0.6至0.8。切勿进行热激。在 5,000 Gs 条件下离心五分钟，使细胞沉淀。加入一毫升冰预冷的 10% 甘油，轻轻涡旋重悬沉淀。然后加入 50 毫升冰冻的 10% 甘油。重复此洗涤步骤一次。最后再次通过离心收集 SW 1 0 6 细胞，弃去上清液，每管保留约 500 微升上清用于重悬。通过轻柔涡旋重悬沉淀，将100 µL Ali Watts分装后在液氮或干冰中速冻，并于-80 °C保存，直至准备进行转化。将fosmid DNA通过电穿孔转入电转

the-production-c-elegans-transgenes-via-recombineering-with-galk

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

生产 C。线虫</em通过重组工程与转基因 galK选择标记

本视频演示了通过显微注射将外源DNA导入秀丽隐杆线虫（C.

利用显微注射法构建稳定的转基因秀丽隐杆线虫

转基因线虫在秀丽隐杆线虫（C.

通过基因枪转化法产生转基因 C. elegans

我们描述了一种增敏方法，利用基于RNAi的基因组筛选和整合的转基因，该转基因表达一种带有荧光标签的功能性蛋白质，以鉴定秀丽隐杆线虫（C.

RNAi 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的胚后表型

系统性、大规模的合成遗传学（基因-基因或上位性）相互作用筛选可用于研究遗传冗余和通路间的串扰。本文中，我们介绍了一种高通量定量合成遗传阵列筛选技术，称为 eSGA，该技术由我们开发，用于阐明大肠杆菌（Escherichia...

绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列

本方案描述了一种利用紫外线（UV）照射将转基因染色体外阵列整合到Caenorhabditis...

一种将高传递率附加体阵列快速整合到 C. elegans 基因组的实验方案

蛋白质通常包含多个可发挥不同细胞功能的结构域。基因敲除（KO）无法考虑这种功能多样性。本文中，我们报道了一种基于重组介导的盒式交换（RMCE）的结构-功能研究方法，该方法应用于基因敲除的胚胎干细胞，可实现对蛋白质不同功能结构域或变异体的分子解析。...

利用重组酶介导的盒式交换在小鼠胚胎干细胞中进行结构-功能研究

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C.

使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在 C. elegans 中快速简便地生成基因组点突变的流程

本文介绍了一种利用带有loxP位点的盒式基因交换突变技术（FLAEM）在Chlamydia...

无标记基因缺失通过Chlamydia trachomatis中带loxP盒的等位交换诱变实现

一种通过CRISPR/Cas9显微注射流程在Caenorhabditis...

利用CRISPR/Cas9介导的内源性荧光标记技术标记生殖系特异性基因 秀丽隐杆线虫

将电生理学技术应用于可及的突触，可对突触活动进行量化测量，有助于分析突触突变体。本文描述了一种用于暴露秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans (C.

解剖并记录秀丽隐杆线虫神经肌肉接头

了解利用重组工程与galK选择标记在秀丽隐杆线虫中生产转基因的方法。该技术保留天然调控元件，通过SMID文库克隆基因组DNA实现高效基因修饰。

利用带有galK可筛选标记的重组工程法构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）转基因

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