生产 C。线虫 galK选择标记

以下实验的总体目标是使用 SMID 文库克隆中携带的蠕虫基因组 DNA 生成转基因。基因组 DNA 的使用保留了三个主要 UTR 区域中的所有天然对照元件，例如增强子。这是通过将 FO smid 移动到 SW 1 0 6 E 大肠杆菌菌株中以利用诱导型 lambda 红重组机制来实现的。

作为第二步，将 GAL K 基因插入 FO smid 中的所需位置，该位置标记了 GFP 或 tap 标签将放置的位点。接下来，通过同源重组用 GFP 或 tap TAC 替换 Gade 基因，然后使用脱氧半乳糖进行负向选择，以产生修饰的转基因。获得的结果表明，通过菌落 PCR 验证 T 插入可以快速、成功地创建这些转基因。

嗨，我叫 Love Ship。我在匹兹堡大学的 Fisher 实验室工作。今天，我将演示制作 C 优雅转基因的技术。

为什么以 GK 作为可选标记进行重组。与现有创建 Cogan 转基因的方法相比，该技术的主要优点是，在这种技术中，我们使用了目标基因的基因组 DNA，因此能够涵盖基因调控的所有关键元件，例如三个主要 UTR 区域的控制元件、替代香料转录本、替代启动子和远端答案，这些在传统的基于标准克隆的方法中可能会遗漏。那么让我们开始吧。

使用 Worm Base 作为指南，从基因服务处订购目标基因或 GOI 的 FO smid 克隆。选择克隆时，我们选择序列中心具有 GOI 的克隆。排除相邻基因的克隆可能更可取，但可能很难找到培养物。

LB 中 GOI 的 SMID 克隆含有每毫升 12.5 微克氯霉素，smid 在 EPI 300 菌株中发送，可以在 37 摄氏度下生长。接下来，在 37 摄氏度下培养 1.5 毫升 SMID 过夜培养物，并小量制备 smid DNA。使用 Epicenter SMID 制备试剂盒，我们遵循说明中描述的替代方案，其中包括在前面的步骤中添加 Ribo 较短混合物，确定 FOSS DNA 浓度。

使用分光光度计磁场通常非常低但足够。用于成功的电穿孔。通过在 14 毫升卡口盖管中，在 32 摄氏度的 LB 培养基中培养 5 毫升过夜培养物，制备电感受态 SW 1 0 6 细胞。

第二天早上。将 1 毫升培养物接种到 2 升培养瓶中的 100 毫升 lb 中。将 SW 1 0 6 细菌培养至 0.6 至 0.8 的 OD 600。

不要热休克。通过在 5， 000 Gs 下离心 5 分钟来沉淀细胞。通过在 1 毫升冰冷的 10% 甘油中轻轻涡旋来悬浮沉淀。

然后加入 50 毫升冰冷的 10% 甘油。重复此洗涤步骤一次。最后，再次离心使 SW 1 0 6 沉淀，DEC 只能使用大约 500 微升的每个上清液 Resus。

通过轻轻涡旋悬浮沉淀，在液氮或干冰中冷冻 100 微升 Ali Watts，并在零下 80 摄氏度下储存，直到准备好转化。通过使用 EOR 25 10 电热器在 1， 350 伏特下在 0.1 厘米间隙比色皿中用约 50 纳克 fos DNA 电显现细菌，将 fosson DNA 转化为电感受态 SW 1 0 6 细胞。将一毫升 LB 中的细菌在 32 摄氏度的 LB 平板上回收 1 小时，并在 32 摄氏度下在 LB 平板上孵育过夜。

通过在 32 摄氏度下用 12.5 μg/mL 氯霉素在 LB 中培养 5 mL 过夜培养物，使用菌落 PCR 验证目标基因的存在。接下来，用 0.5 μL 培养物与侧翼寡核苷酸进行标准 PCR 反应，并将初始 95 摄氏度孵育至 5 分钟，以便在反应前对细菌进行切片。最后，准备用于长期储存的甘油原液，以将 gal K 基因插入携带目标基因的 FO smid 中。

首先，准备含有 0.2% 半乳糖的拖把最小培养基板。有关配方，请参阅本协议的书面部分。接下来 PCR 扩增 P mod 4 gal、k、g 或 P mod 4 gal K GT 盒。

我们使用 fusion 或 go tac gel。纯化所得 PCR 产物。在凝胶上或使用 NanoDrop 分光光度计定量产量。

将 PCR 产物储存在 4 摄氏度直至准备使用，接种 5 毫升氯霉素和含有 SW 1、0、6 的含有 Foss DNA 的细胞，在 32 摄氏度下生长过夜。将 1 毫升过夜培养物添加到 100 毫升 lb 和氯霉素中。在 2 L 培养瓶中，生长至 0.6 至 0.8 的 OD。

在培养物生长期间，这通常需要 3 到 4 个小时。将振荡水浴设置为 42 摄氏度，以便在支架中使用无菌 250 ml 烧瓶进行预热。下一步使用振荡水浴对于获得高效率至关重要。

接下来，将 50 毫升 SW 1 0 6 培养物转移到 250 毫升培养瓶中，并在 42 摄氏度和 100 RPM 的温度下在振荡水浴中热休克 20 分钟。将剩余的细菌保持在 32 摄氏度，用作未诱导的对照。将诱导和未诱导的细菌在冰上冷却 10 分钟。

将样品转移至两个无菌离心管中，以约 5， 000 G 的浓度沉淀 5 分钟。倒出所有上清液，轻轻涡旋，将沉淀重悬于一毫升冰冷的 10% 甘油中。再加入 49 毫升冰冷的 10% 甘油。

重复此洗涤，然后再次沉淀。倒置试管去除上清液，并将沉淀重悬于少量剩余液体 Eloqua 中，放入 100 μL 样品中。在干冰上冷冻，第二天在零下 80 摄氏度下储存。

电游行，在 25 吨 einor电光栅中使用 0.1 厘米间隙比色皿，用 150 ng 制备的 PCR 产物对诱导和未诱导的 SW 1 0 6 细胞进行电游行。设置为 1， 350 伏。在 14 毫升 Falcon 管中回收 1 毫升 LB 中的细菌。

32 摄氏度下孵育 4 个半小时，孵育后以 13， 200 RPM 沉淀细菌 15 秒，然后重悬于 M 9 培养基中。有关食谱，请参阅本协议的书面部分。重复此洗涤步骤两次。

要去除任何丰富的培养基，请再次沉淀细胞，然后重悬于 1 mL M 9 中，然后在拖把上铺板连续稀释。最小培养基在 32 摄氏度下在培养箱中孵育 3 到 5 天。请耐心等待，因为真阳性会缓慢生长，在 Macon 琼脂上划线一个菌落以纯化菌落并验证它是 GLK 阳性。

菌落应变为亮粉色。挑选一个菌落，接种 5 ml lb 加氯霉素过夜培养物，在 32 摄氏度下孵育。使用侧翼寡核苷酸通过 PCR 确认将 gal 笼插入到正确的位置。

请参阅本协议书面部分的表 1。对于寡核苷酸序列，在标准 PCR 反应中加入 0.5 μL 培养物，并将初始 95 摄氏度孵育至 5 分钟以溶解细菌。由于 GAL K 基因的存在，PCR 产物的大小应向上偏移。

最后，准备用于储存的甘油原液。准备含有 0.2% 脱氧半乳糖或 DOG 和 0.2% 甘油的拖把最小培养基板。有关配方，请参阅本协议的书面部分。聚合酶链反应 （PCR）。

使用与第一轮相同的寡核苷酸或使用较短的 GFP 或 TAP 特异性寡核苷酸，扩增来自 PMO 4G、FP、PBS 1761 或 PBS 1479 的标签片段。如果要制备多个构建体，则使用较短的寡核苷酸特别有用，因为相同的 PCR 产物可用于所有构建体 Gel。如前所述，纯化 PCR 产物并测量凝胶上或用分光光度计生成诱导和非诱导感受态 W 1 0 6 细胞，携带带有 Gale K 基因的 SMID 的诱导和非诱导感受态 W 1 0 6 细胞，使用 0.1 厘米间隙 Q vets 在 EINOR 25 10 ator 设置为 1 中，用约 100 ng 的 PCR 产物食用诱导和未诱导的 SW 1 0 6 细胞， 350 伏特。

在 14 mL 卡口盖管中回收 1 mL LV，并在 32 摄氏度摇床中孵育 4 小时半。如前所述，在 M 9 中洗涤并稀释细胞。将细菌铺在拖把上，含有 0.2%DOG 和 0.2% 甘油的最小培养基将板在 32 摄氏度下孵育三天，以确认插入的存在。

使用 4 个菌落以 12.5 μg/mL 的 LB 接种 5 mL 过夜培养物。氯霉素如前所述进行菌落 PCR。我们同时使用较短的 GFP tap 特异性寡核苷酸和侧翼寡核苷酸来展示正确的插入片段和正确的位点。

GFP 约为 800 个碱基对。TAP 约为 550 个碱基对，gal KT 为 1.4。千碱基最后准备用于长期储存的甘油储备液。

通过重组对 FO smed 进行修饰可获得稳健的结果，并且在阴性选择步骤中通常观察到超过 90% 的成功率。此外，该方案大约需要两周时间才能完成，这使得转基因的制备相当迅速，显示我们在 DOG 板上鉴定了 48 个菌落，并使用旗帜 GFP 寡核苷酸用于菌落 PCR，该寡核苷酸在本实验中扩增了 GFP 插入片段。48 个菌落中有 47 个是正确的，1 个菌落未正确修饰，显示在 DOG 板上鉴定出的 48 个菌落，并使用 GFP 寡核苷酸标志进行菌落 PCR，该寡核苷酸在本实验中扩增了 GFP 插入片段。

48 个菌落中有 46 个是正确的，2 个菌落没有被正确修饰。在进行此实验时要记住的最重要的一点是 SW 1 0 6 细菌必须在 32 摄氏度而不是更高温度下生长，因为在较高温度下生长会选择突变体，突变会损害 Lambda 红色机制。所以祝你的实验好运。