Name: 分离和激活线虫精子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-31T19:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 学习从雄性秀丽隐杆线虫中分离和激活精子细胞的方法，通过蛋白酶处理实现体外激活，并利用显微镜观察精子形态。该方案为研究生殖生物学和精子功能提供了可靠的实验基础。

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我们感谢 Samuel Ward、Diane C. Shakes 和 Gregory Nelson 率先开创了这一技术。我们感谢 Pavan Kadandale 和 Brian Geldziler 提供展示激活精子的视频；感谢 Singson 实验室成员的有益讨论；感谢 CGC 提供菌株，以及美国国立卫生研究院通过资助项目（R01HD054681）对我们的支持。

1) 富集雄性群体
<ol>
	<li>根据实验需求，可通过以下策略之一获得大量雄性个体：
		<ol>
			<li>通过将5只野生型雄虫与1只雌雄同体虫在NGM平板中央接种的小片OP50菌苔上交配，可获得大量野生型雄虫后代。下一代中约有50%为野生型雄虫。</li>
			<li>him-5(e1490）或 him-8(e1489) 雌雄同体产生大量雄性个体。 him-5 和 him-8 雄性具有生育能力，且精子形态和功能无明显缺陷。因此， him-5 或 him-8 雄性可用于 取而代之 许多实验所需的野生型雄性个体。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2）雄性的鉴定与分离
<ol>
	<li>检查蠕虫的尾部形态；雄性蠕虫的尾部呈圆形。</li>
	<li>挑选L4期雄虫，转移至接种有细菌的NGM平板 E. coli OP50 并培养一到两天。在无雌雄同体线虫的情况下培养雄虫，可防止精子流失，从而在实验过程中获得大量精细胞。</li>
	<li>解剖当天，将未交配的雄虫转移至不含细菌的NGM平板上，让其爬行数分钟。此步骤有助于去除虫体表面的少量细菌层 E. coli 黏附在蠕虫表面。或者，用移液器吸取少量M9缓冲液（6g Na2HPO4，3g KH2PO4，5 g NaCl，0.25 g MgSO₄4.7H2在表面皿中加入每升含 O 的缓冲液，然后将雄性个体转移至该缓冲液中。</li>
</ol> 
3) 雄性个体的解剖与 体外 激活
<ol>
	<li>取一片载玻片，用记号笔在上面画一个小圆圈。在圆圈内加入30-50 μl的1X精子培养基（50 mM HEPES，25 mM KCl，45 mM NaCl，1 mM MgSO4，5 mM CaCl2，10 mM葡萄糖；pH 7.8）。疏水性圆圈有助于将精子培养基限制在圈内。</li>
	<li>将5-10只雄虫转移至精子培养基中。</li>
	<li>将载玻片置于显微镜下观察，双手各持一支连接27号针头的注射器。</li>
	<li>用其中一根针头固定线虫，另一根针头切断雄虫的后端以释放精子细胞。</li>
	<li>切断线虫通常会立即释放大量精子细胞。在体视显微镜下，精子细胞呈现为微小的“颗粒”状。然而，有时部分或大部分精子细胞可能仍保留在虫体残骸内。此时，可轻轻在载玻片上“拖动”虫体残骸，以促进精子细胞的释放。</li>
	<li>为激活精子细胞，可在含Pronase E（20 μg/ml）的1X精子培养基中进行解剖，并静置5分钟。</li>
	<li>实验过程中任何时候均不得让载玻片干燥。必要时可补充更多1X精子培养基。</li>
</ol>
4) 精子细胞和精子的观察
<ol>
	<li>将盖玻片轻轻放置在解剖样本的表面。</li>
	<li>在低倍镜（10X）下找到精子细胞的视野。</li>
	<li>通过转换至高倍镜——通常使用100X油镜——可观察精子细胞或精子的精细结构。</li>
</ol>
5) 代表性结果
雄性秀丽隐杆线虫（C.）分离的精子细胞的微分干涉相差（DIC）图像示例 elegans 如图1所示。精子细胞呈球形，细胞核明显。 体外 图2显示了激活的精子。
<img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig1.jpg" alt="单细胞微生物的显微镜图像；关注静态排列和形态学研究。" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图1"> 图1. C. elegans 精细胞的微分干涉差（DIC）图像。
<img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig2.jpg" alt="Yeast cells; microscope image; cell morphology analysis; fermentation research; biology study." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Figure 2"> 图2. 微分干涉相差（DIC）图像 体外 活化的 秀丽隐杆线虫 精子

<ol><li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+of+germline+stem+cells%2C+entry+into+meiosis%2C+and+the+Sperm%2FOocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).</li>
<li>Lhernault, S. W., Roberts, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLhernault%2C+SW+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. , Vol. 48 273-301 (1995).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 91, 67-94 (1979).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+male+C.+elegans+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22WormAtlas%22%5BJournal%5D)">Introduction to male C. elegans anatomy.</a> WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).</li>
<li>Shakes, D., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+spermiogenesis+in+C.+elegans%3A+a+pharmacological+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis.</a> Dev Biol. 134, 189-200 (1989).</li>
<li>Nelson, G. A., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+fusion%2C+pseudopod+extension+and+amoeboid+motility+are+induced+in+nematode+spermatids+by+the+ionophore+monensin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin.</a> Cell. 19, 457-464 (1980).</li>
<li>L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+cell+biology+of+spermatogenesis+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).</li>
<li>Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+spe-38+gene+encodes+a+novel+four-pass+integral+membrane+protein+required+for+sperm+function+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization.</a> Development. 132, 2795-2808 (2005).</li>
<li>Xu, X., Sternberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+sperm+TRP+protein+required+for+sperm-egg+interactions+during+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization.</a> Cell. 114, 285-297 (2003).</li>
<li>Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+spermatozoan+locomotion%3A+amoeboid+movement+with+almost+no+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin.</a> J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).</li>
<li>Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chloride+channel+localizes+to+Caenorhabditis+elegans+spermatids+and+chloride+channel+blockers+induce+spermatid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation.</a> Dev Biol. 176, 1-16 (1996).</li>
<li>LaMunyon, C., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+viability+of+mutant+and+manipulated+sperm+by+artificial+insemination+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 138, 689-692 (1994).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

除了分析精子发生突变体（Spe突变体）外，本实验方案还有其他重要应用，例如分析精子形态随衰老的变化。通过本方案分离得到的精子细胞和精子可应用于其他下游实验，如对野生型和突变型精子进行免疫染色8, 9、在载玻片上检测精子运动能力10、生理学指标测定9, 11，甚至人工授精实验12。

<table><tbody><tr><td>结核菌素注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td>注射器：1 ml，针头：&lt;br/&gt;27G × &amp;#189; in</td></tr><tr><td>组织标记笔</td><td>Zymed Laboratories, Inc.</td><td>00-8888</td><td></td></tr><tr><td>VWR VistaVision HistoBond 显微镜载玻片</td><td>VWR international</td><td>16004-406</td><td>尺寸：&lt;br/&gt;75×25×1 mm</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR international</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6911</td><td></td></tr></tbody></table>

分离与 体外 激活 秀丽隐杆线虫 精子

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

雄性和雌雄同体是线虫秀丽隐杆线虫（C. elegans）中两种自然存在的性别形式。无性繁殖型的精子由雄性和雌雄同体个体共同产生。在配子发生的早期阶段，雌雄同体的生殖细胞会分化形成数量有限的精子——约300个——并储存在一个称为储精囊的小“囊”中。随后，雌雄同体会持续产生卵母细胞（oocytes）1。相比之下，雄性在整个成虫期只产生精子。雄性产生的精子数量极多，占典型成虫体内总细胞数的&gt;50%2。因此，从雄性个体中分离精子比从雌雄同体个体中更为容易。
由于X染色体自发不分离，自然产生的雄性仅占极小比例3。通过将雌雄同体与雄性杂交，或更方便地引入突变以产生雄性高频率（Him，High Incidence of Males）表型，是富集雄性群体的一些策略3。
通过观察尾部形态可以很容易地区分雄性和雌雄同体个体4。雌雄同体的尾部呈尖细状，而雄性尾部则呈圆形，并具有交配结构。
剪断尾部可释放出储存在雄性生殖道内的大量精子细胞。解剖操作在体视显微镜下使用27号针头进行。由于精子细胞不与其他细胞存在物理连接，液压可将雄性体内包括精子细胞在内的内含物排出2。
将雄性个体直接解剖于一滴“精子培养基”上。精子细胞对pH值的变化较为敏感，因此在精子培养基中使用具有良好缓冲能力的化合物HEPES。培养基中存在的葡萄糖及其他盐类有助于维持渗透压，从而保持精子的完整性。
精子细胞在减数分裂后的分化过程称为精子形成或精子激活。Shakes5，和 Nelson6 先前研究表明，通过添加包括Pronase E在内的多种激活化合物，可诱导圆头精子细胞分化为精子。本文中我们证明 体外 精子形成过程 秀丽隐杆线虫 使用Pronase E处理精子细胞。
成功的精子形成是生育力的前提，因此在精子形成过程中存在缺陷的突变体均表现为不育。迄今为止，已有多个突变体被证实特异性地在精子形成过程中存在缺陷。7. 检查期间发现异常 体外 激活新的 Spe（精子发生缺陷）突变体将有助于我们发现参与该过程的其他因子。

本文介绍了一种从雄性 C. elegans 中分离并激活精子细胞的实验方案。通过切断雄性尾部可释放出精子细胞，加入蛋白酶可激活这些精子细胞。

雄性和雌雄同体是线虫秀丽隐杆线虫（C. elegans）中两种自然存在的性别形式。变形虫状的精子由雄性及雌雄同体个体均能产生……

本实验的总体目标是观察精子形态。首先需提前一天将雄性个体分离，以备解剖。实验的第二步是解剖雄性个体以释放精子。该实验步骤的第三步是观察精子形态。实验步骤的最后一步是为后续应用制备精子。最终可获得结果，显示精子形态及其通过体外激活剂处理后被激活的能力。精子分离与激活方案最初由 Sam Ward、Diane Shakes 和 Gregory Nelson 在 30 多年前开发。目前我们使用该方法来鉴定影响秀丽隐杆线虫（C. elegans）精子功能和生育力的突变。该方法的总体目标是观察秀丽隐杆线虫精子的形态。这一过程首先需要在解剖前一天将雄性个体隔离，以确保其处于禁欲状态。第二步是解剖雄性个体，以释放出圆形的非典型精子细胞。第三步是在体外观察精子细胞活化过程，直至其发育为成熟的AME精子形态。该实验步骤将由实验室的三位博士后研究员 Dr. Matt Marchello、Dr. Chatterjee 和 Dr. Guna SLU 演示，以分离精子。首先，通过将五只野生型雄虫与一只雌雄同体虫在 NGM（线虫生长培养基）平板中央接种于大肠杆菌 OP50 菌落的小块菌苔上进行杂交，获得大量雄性个体。大约下一代中50%为需要收集的野生型雄虫。在解剖显微镜下观察L四期雄虫的发育阶段和尾部形态。根据尾部形态挑选L四期线虫。雄性线虫具有圆形尾部，而雌雄同体线虫具有尖形尾部。使用铂金丝，每次实验挑选七至十只L4期雄性线虫，将其转移至接种了OP50的大肠杆菌NGM平板上，培养一至两天。在没有雌雄同体的情况下培养禁欲雄虫，可防止精子丢失，从而在实验过程中获得大量精子。在开始解剖之前，使用6克无水磷酸氢二钠、3克磷酸二氢钾、5克氯化钠、每升0.25克七水合硫酸镁以及5毫升精子激活培养基，配制一升M9缓冲液。用于精子激活的M9缓冲液和精子培养基均需使用经高压灭菌或滤膜除菌的储备液配制。在解剖当天，将未交配的雄虫转移至不含细菌的NGM平板上，让其爬行数分钟。此步骤有助于去除黏附在蠕虫体表的一层少量大肠杆菌。或者，用移液器吸取少量M9缓冲液至表面皿中，并将雄虫转移至缓冲液内。接着，使用防扩散笔在玻璃载片上画一个小圆圈，在圆圈内加入30至50微升的1×精子培养基。防扩散笔形成的疏水圈有助于将精子培养基限制在划定的区域内。在解剖显微镜下，将五到十只雄虫转移至精子培养基中。根据操作习惯手持一支或两支注射器，双手均连接27号针头，用其中一根针头固定线虫，另一根针头切断雄虫的后端以释放精子。在体视显微镜下，释放的精子细胞可见为微小颗粒。然而，有时部分或大部分精子细胞可能仍保留在 carcass 内。在此情况下，轻轻拖动 carcass 经过玻片表面，可促进精子细胞从 carcass 中释放。为了观察精子细胞的活化情况，需在含有P型蛋白酶活性单位的x精子培养基中解剖线虫。在解剖显微镜下，让线虫静置五分钟

isolation-and-in-vitro-activation-of-caenorhabditis-elegans-sperm

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

分离和<em在体外激活线虫精子

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线虫在实验室中易于繁殖——部分原因是其雌雄同体可通过自体受精进行繁殖。 然而，遗传杂交及其他实验可能需要大量雄性个体。 本视频介绍了一种富集雄性 C. elegans...

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我们在此介绍一种用于大规模培养胚胎的改进方案 秀丽隐杆线虫 细胞。胚胎 秀丽隐杆线虫 培养的细胞 体外 使用该方法，似乎能够以细胞特异性的方式分化并重现基因的表达。可对其他组织中特定细胞类型进行直接访问或分离的技术可应用于 秀丽隐杆线虫...

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精子必须成功穿过输卵管才能使卵子受精。本文中，我们描述了一种用于检测秀丽隐杆线虫（C.

测量精子导向性与运动能力 秀丽隐杆线虫 雌雄同体生殖道

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使用EGFR和RAS抑制剂的鉴定 秀丽隐杆线虫

此处，我们介绍一种从4龄幼虫阶段分离活性核提取物的详细方案 秀丽隐杆线虫 并可视化转录活性在其中的活动 体外...

活性分离 秀丽隐杆线虫 核提取物制备与重组 体外 转录

本文介绍了一种利用模式生物 C. elegans...

测量胚胎活力与子代数量 秀丽隐杆线虫

本方案建立了提取和量化秀丽隐杆线虫（C.

秀丽隐杆线虫中挥发性性信息素的提取与化学吸引测定

体内可视化受精及早期发育过程中的钙瞬变 秀丽隐杆线虫

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