分离和

该程序的总体目标是可视化精子形态。这是通过首先提前一天分离雄性进行解剖来实现的。该程序的第二步是解剖雄性以释放精子。

该程序的第三步是可视化精子形态。该程序的最后一步是准备用于下游应用的精子。最终，可以获得显示精子形态和通过体外激活剂治疗激活能力的结果。

精子分离和激活方案于 30 多年前由 Sam Ward、Diane Shakes 和 Gregory Nelson 首次开发。我们目前使用该程序来表征 C 优雅中改变精子功能和生育能力的突变。该程序的总体目标是可视化 CL elgan，一种 OID 精子形态。

这是通过在解剖前一天隔离雄性以保持独身来实现的。第二步涉及解剖雄性以释放圆形非模态精子细胞。第三步是将精子细胞在体外激活可视化为成熟的 AME 精子形态。

该程序将由实验室的三名博士后研究员 Matt Marchello 博士、Chatterjee 博士以及 Guna SLU 博士演示，以分离精子。首先，通过在大肠杆菌的小草坪上杂交 5 只野生型雄性和 1 只雌雄同体来获得大量雄性。位于线虫生长培养基或 NGM 板中心的 OP 50 细菌。

大约 50% 的下一代将是野生型雄性需要收集。L 四期雄性在解剖显微镜下检查发育阶段和尾巴形态。根据尾部形态挑选 L 四期蠕虫。

雄性蠕虫的尾巴是圆的，而雌雄同体的尾巴是尖的。使用铂丝，每个实验挑选 7 至 10 L 四期雄性，并将它们转移到接种有 OP 50 的 NGM 板中，让它们生长一两天。在没有雌雄同体的情况下生长独身雄性可以防止精子的丢失，因此在实验过程中将有大量的精子可用。

在开始解剖之前，使用 6 克磷酸氢二钠、3 克磷酸二钾、5 克氯化钠、0.25 克硫酸镁、每升 hep 至 hydrate 和 5 毫升精子培养基制备 1 升 M 9 缓冲液和精子培养基 为了激活精子，M 9 缓冲液和精子培养基由高压灭菌或过滤灭菌的原液制备。解剖当天，将独身雄性转移到没有细菌的 NGM 板上，让它们爬行几分钟。此步骤有助于去除粘附在蠕虫表面的一小层大肠杆菌。

或者，在手表镜中吸取少量 M nine 缓冲液，然后将雄性转移到缓冲液中。接下来，使用拍打笔，在玻璃滑管上以 30 至 50 微升的 1 x 精子培养基在圆圈内标记 A.小圆圈。拍打笔的疏水圈有助于将精子培养基保持在边界内。

使用解剖镜将 5 到 10 只雄性转移到精子培养基上。根据舒适度，可容纳一个或两个注射器。在您的双手上连接 27 号针，用一根针固定蠕虫，用另一根针切开雄性的后端以释放 sids。

释放的精子细胞在立体显微镜下以微小颗粒的形式可见。然而，有时部分或大部分精子细胞可能会保留在胴体内。在这种情况下，轻轻地将尸体拖到载玻片上可能有助于从尸体中释放精子细胞。

为了观察精子细胞的激活，在含有 P 链霉蛋白酶 E 的 x 精子培养基中解剖蠕虫，在解剖显微镜下，让蠕虫静置 5 分钟。活化的精子会有伪足。轻轻地将盖玻片放在解剖样品的表面。

找到 100 倍放大倍率下的精子细胞区域。精子细胞呈圆形。图 1 显示了从雄性 C 优雅中分离的精子细胞的 DIC 图像示例。

精子细胞呈球形，细胞核突出。体外活化的精子如图二所示，精子有一个突出的伪足。如果需要，80% 至 95% 的精子细胞转化为精子。

该程序的最后一步可以是为下游应用准备精子。例如，可以固定精子进行免疫荧光。最终，获得的结果可以显示体外激活精子和测定精子形态的能力。