Name: 在人T淋巴细胞的全细胞钙释放激活的钙记录（CRAC）的电流 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: 学习在人T淋巴细胞中使用全细胞膜片钳技术记录钙释放激活钙电流的方法。该方案利用FSA garin阻断SERCA泵以耗竭钙库，从而可靠地测量CRAC通道的内源性钙电流和钠电流，为研究T细胞钙信号传导及免疫相关疾病提供重要工具。

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我们感谢加利福尼亚大学戴维斯分校生理学与膜生物学系为我们提供了研究离子通道所需的设施和优良环境。

1. 静息人T淋巴细胞的制备
<ol>
 <li>使用 RosetteSep 人 T 细胞富集试剂和 RosetteSep 密度介质，根据制造商说明书从人血液样本中纯化 T 细胞。所得细胞群体应包含 95% CD3+ 静息 T 细胞。我们依据加州大学戴维斯分校机构审查委员会批准的方案，从健康志愿者外周血样本中纯化人 T 淋巴细胞。</li>
 <li>分离后，将静息 T 细胞重悬于细胞培养基中，细胞密度为 0.5 x 106 细胞/mL，培养基成分为含谷氨酰胺和 HEPES 的 RPMI-1640 培养基，并添加 10% 胎牛血清、2% GlutaMAX-I、1% RPMI 1640 维生素溶液、1% RPMI 1640 氨基酸溶液、1% 丙酮酸钠和 0.03% β-巯基乙醇。</li>
 <li>将细胞悬液置于细胞培养瓶中，在 37°C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育，实验前最多可维持 24 小时。</li>
</ol>
2. 记录室的制备
<ol>
 <li>制备记录室所需材料如下：a) 硅胶O形圈，b) 经70%乙醇和蒸馏H2O清洗的圆形25 mm盖玻片，c) 按照生产商说明配制的混合Sylgard184，以及d) 两个60 × 15 mm的培养皿。</li>
 <li>将约0.5 mL混合Sylgard184加入一个60 × 15 mm培养皿中。</li>
 <li>使用镊子将O形圈的底部浸入Sylgard184中。</li>
 <li>将O形圈置于洁净表面（如另一个培养皿）上，去除其边缘多余的Sylgard184。</li>
 <li>将O形圈放置在盖玻片上并压紧。</li>
 <li>通过在85°C下加热40–60分钟或直至Sylgard184完全聚合，使其固化。</li>
 <li>将记录室存放于无尘容器中。</li>
</ol>
3. 制备膜片钳电极
<ol>
 <li>实验当天，使用玻璃毛细管和拉管仪拉制尖端直径约为 2-μm 的移液管。我们采用带细丝的硼硅酸盐玻璃管（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm）。将移液管存放于无尘环境中。</li>
 <li>根据标准操作流程9，使用Sylgard184或HIPEC R6101半导体保护涂层对移液管尖端进行包被。</li>
 <li>实验前轻轻进行火焰抛光处理。</li>
</ol>
4. 膜片钳装置准备
<ol>
 <li>在控制膜片钳放大器的软件中配置并保存用于形成千兆欧封接的宏。我们使用由 Windows XP 和 Pulse 软件支持的 EPC-10 放大器进行数据采集。我们根据 EPC-10 手册设置"建立"、"细胞贴附"和"全细胞"宏，并将其用于所有实验。</li>
 <li>按照表1列出的成分配制浴液和移液管溶液，并在实验前将其储存于 4° C 长达1周。</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>化学试剂</td>
 <td colspan="3">灌流液（mM）</td>
 <td>电极内液（mM）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td># 1</td>
 <td># 2</td>
 <td># 3</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
 <tbody>
 <tr>
 <td>CH3SO3Na</td>
 <td>130</td>
 <td>110</td>
 <td>125</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>2</td>
 <td>4</td>
 <td>5</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ca(OH)2</td>
 <td>-</td>
 <td>20</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2</td>
 <td>3</td>
 <td>1</td>
 <td>-</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEDTA</td>
 <td>-</td>
 <td> </td>
 <td>10</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>1</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cs-aspartate</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>125</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAPTA</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>12</td>
 </tr>
<tr>
<td>葡萄糖</td>
<td>10</td>
<td>10</td>
<td>10</td>
<td>-</td>
</tr>
 </tbody>
</table>
表1. 全细胞CARC电流记录用溶液。
所有化学品均购自 Sigma-Aldrich，St. Louis, MO。
<ol start="3">
 <li>测定膜片钳电极液与每种灌流液之间的液接电位（LJ）10。使用数据采集软件将LJ值保存在适当位置。例如，在Pulse程序中，将LJ值输入“放大器”窗口中的“LJ”控制项。</li>
 <li>在实验开始前，按照图1所示，在数据采集软件的适当位置配置并保存刺激方案。在Pulse程序中，我们在“脉冲生成”窗口中设置采集协议。 <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="电压钳方法示意图，显示膜电位在 -120 mV、30 mV 和 100 mV 的阶跃变化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 刺激方案。 每0.2 - 2秒（5 - 0.5 Hz）施加一次持续50毫秒的电压斜坡，从-120 mV升至+100 mV。斜坡之间的钳制电位（Vh）维持在+30 mV。</li>
</ol>
5. 将细胞固定在显微镜载物台上
<ol>
 <li>用多聚赖氨酸（poly-L-lysine）包被记录室约 20 分钟，然后用 H2O 洗涤，再用 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）洗涤，之后接种细胞。</li>
<li>将含有 0.2–0.5 × 106 个细胞的 500 μL 细胞悬液接种至记录室中，并在 37°C 下孵育 20 分钟。</li>
<li>将带有贴壁细胞的记录室固定于记录室支架中。我们使用定制的记录室支架，其底部支撑盖玻片的下方，而上部则轻轻压住盖玻片的上方。</li>
<li>将记录室支架置于倒置显微镜的载物台上。</li>
<li>在透射光下对细胞进行调焦。我们使用 40X 油浸物镜。</li>
<li>将 Ag/AgCl 参比电极插入浴液中。</li>
<li>校准多通道重力驱动灌流系统。进液管的尖端应以 45° 角靠近视野区域放置于盖玻片附近。</li>
<li>将吸液管置于进液管尖端的对侧位置。</li>
<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）或 HBSS 对记录室进行灌流，以洗去细胞培养基及未牢固贴附的细胞。</li>
</ol>
6. CRAC 通道电流记录
<ol>
 <li>找到一个牢固贴附在盖玻片上的细胞。我们通常选择大小适中、呈圆形且表面光滑的细胞。 </li>
 <li>用含钙溶液灌注记录室2+无镁，3 mM Mg2+含浴液 #1（表 1），其中含有 0.5-1 μM 使用毒胡萝卜素（thapsigargin）处理 8-10 分钟，以阻断 SERCA 泵。此步骤旨在形成吉欧密封（gigaseal）前耗尽细胞内钙库。 </li>
 <li>使用 Eppendorf 微量移液器和 P-20 移液枪，将电极内液（表 1）注入记录电极中，并将记录电极插入放大器头部的电极夹持器内。Ca2+ 螯合剂BAPTA被加入到移液管溶液中，以被动耗竭钙库并降低Ca2+依赖性CRAC通道失活</li>
 <li>施加少量正压（约3英寸水柱）2O）在进入浴液之前，使用定制的压力-吸力装置连接加压空气和真空管路，以在膜片钳电极内产生正压或负压。 </li>
 <li>在显微镜下通过视觉控制将记录电极移入浴液中。在“示波器”窗口中，应观察到有电流流经电极。此时，预设宏程序施加的小幅度电压脉冲（测试脉冲）应引起电流幅度的阶跃式变化。由此可测定电极电阻值。本实验所用电极的电阻通常为5–6 MΩ。</li>
 <li>校正移液管与参比电极之间产生的“零点”电位。</li>
 <li>在显微镜的视觉控制下，将移液器尖端靠近细胞，直至接触细胞膜。</li>
 <li>施加负压（20–40 英寸 H₂O）2O）置于膜片移液管内。 </li>
 <li>在“示波器”窗口中监测千兆欧姆封接的形成。您将观察到由测试脉冲引起的电流幅度减小，同时移液管电阻值上升至 &gt;5 GΩ。通常在几秒内形成吉欧姆封接，但可能需要1-2分钟才能获得稳定的吉欧姆封接。</li>
 <li>补偿移液器电容（“C-Fast”）。 </li>
 <li>使用20 ml注射器施加额外负压以击破膜片。</li>
 <li>将钳制电位设置为 +30 mV。正的钳制电位有助于防止钙依赖性的CRAC通道失活。</li>
 <li>补偿细胞的膜电容（“C-slow”）；保存或记录C-slow的数值。 </li>
 <li>检查接入电阻“R”的数值s。在我们的实验中，Rs 通常为 7-20 MΩ。</li>
 <li>以0.5 Hz的频率开始施加一系列电压斜坡（图1）至Ca2+不含 3 mM Mg2+含浴液 #1。在此溶液中，由于CRAC通道对Mg的通透性较差，CRAC电流相较于“漏”电流可忽略不计2+保存并将在灌流液#1中记录的当前轨迹用于后续分析，作为“漏”电流。在-100 mV时，“漏”电流的绝对幅值应小于或等于5 pA。若细胞“漏电”，则终止实验，更换新的膜片钳电极和新的细胞重新开始。</li>
 <li>为了记录 Ca2+ 通过CRAC通道的电流（ICa-CRAC), 替换 Ca2+无镁 3 mM Mg2+含20 mM Ca的浴液#12+-通过切换灌流阀，更换为含浴液#2（表1），以实现Ca2+ 通过CRAC通道流动并产生内向电流。在“示波器”窗口中，您将观察到内向整流I的形成过程。Ca-CRAC （图2）。由于Ca，在负电压下的电流幅度将在约1分钟内持续增加2+依赖性CRAC电流增强</li>
 <li>以电压梯度将刺激频率增加至 5 Hz，这是记录瞬时 Na+ 通过CRAC通道的电流</li>
 <li>更换 20 mM Ca2+含 Na 的浴液 #2+-通过切换灌流阀，更换为无双价阳离子溶液 #3（表 1）。在“示波器”窗口中，您将观察到幅值较大的瞬时内向整流 Na+ 通过CRAC通道的电流（INa-CRAC；图2）。</li>
 <li>可加入 20 mM Ca2+含浴液 #2，含 1-5 μM La3+ 实验结束时记录“漏电流”。然而，我们发现这种方法并不实用，因为“漏电流”会随时间变化，实验结束时可能变大或变小。我们更倾向于采用在 Ca 记录的电流2+不含 3 mM Mg2+实验开始时，将含浴液 #1 的电流作为“漏电流”进行记录。</li>
 <li>保存记录的电流轨迹，以供进一步分析。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
 <li>将保存的电流记录导入分析软件。我们使用 Pulse 程序进行分析。</li>
 <li>测量电压斜坡起始和结束时的电流幅度。我们通常在 Pulse 程序的“示波器”窗口中使用成对光标，测量 -100 mV 和 +100 mV 时的电流幅度。</li>
 <li>将电流幅度值导出至图形处理软件，用于进一步分析和图形呈现。我们使用 Origin 科学绘图与数据分析软件（版本 7）。</li>
</ol>
8. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="显示离子电流（I）与膜电压（Vm）分析的电生理学实验示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 静息人 T 细胞中的 CRAC 电流。 （A），在全细胞电压钳制模式下于 -100 mV（实心圆）和 +100 mV（空心圆）记录的 CRAC 电流的时间过程。在形成吉欧封接（gigaseal）之前，细胞在含 3 mM Mg2+ 的无 Ca2+ 浴液 #1 中预孵育约 10 分钟，该溶液含有 0.5 μM 毒胡萝卜素（thapsigargin）。破膜后，依次施加以下浴液：含 3 mM Mg2+ 的无 Ca2+ 浴液 #1（0 Ca + 3 Mg），随后为含 20 mM Ca2+ 的浴液 #2（20 Ca），接着为无二价阳离子的浴液 #3（DVF），最后再回到浴液 #2（20 Ca）。细胞受到如图 1 所示的一系列电压斜坡刺激。在浴液 #3（DVF）中，斜坡频率为 5 Hz，而在所有其他溶液中为 0.5 Hz。注意在施加含 20 mM Ca2+ 的浴液 #2 后 ICa-CRAC 的缓慢发展，以及在 DVF 浴液 #3 中 INa-CRAC 的快速瞬时发展。（B），在含 3 mM Mg2+ 的无 Ca2+ 浴液 #1（“漏电流”）、含 20 mM Ca2+ 的浴液 #2（20 Ca）以及浴液 #3（DVF）中电压斜坡期间记录的代表性电流轨迹。（C, D），通过从含 20 mM Ca2+ 的浴液 #2（20 Ca）和浴液 #3（DVF）中记录的电压斜坡电流中减去“漏电流”所获得的 ICa-CRAC（C）和 INa-CRAC（D）的电流-电压关系，如图（B）所示。

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在静息人T细胞中进行CRAC电流的电生理学研究是一项具有挑战性的任务，因为这些细胞的内源性CRAC电流幅值较小，其原因是细胞尺寸小（静息人T细胞的直径范围为5-8 μm）。本文中，我们提供了一种逐步操作流程，用于可靠地记录从外周血单个核细胞中分离出的静息人T淋巴细胞中的CRAC电流。该技术使我们能够研究静息T细胞中CRAC通道的生理特性及功能表达，从而更深入地理解正常与病理状态下免疫细胞反应的本质。利用本实验方案，不仅可以检测静息人T细胞中的CRAC电流，还可用于其他免疫细胞，如活化人T细胞、单核细胞和巨噬细胞中的CRAC电流测量。

<table><tbody><tr><td>人T细胞富集鸡尾酒试剂 RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep 密度介质</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>含谷氨酰胺/HEPES的RPMI 1640培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I（100倍溶液）</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 维生素溶液（100倍）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>1640 氨基酸溶液（50倍）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸肌醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>氯化镧</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>毒胡萝卜素（Thapsigargin）</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>HIPEC R6101 半导体防护涂层</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63-500 系列高性能隔振实验台</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>EPC 10 膜片钳放大器及前置放大头级</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>配备40倍油镜的奥林巴斯IX71倒置显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Windows 计算机</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulse 软件</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 科学绘图与分析软件</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>膜片钳移液电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>含丝硼硅酸盐玻璃（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm）</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Narashige&amp;rsquo;s 微电极烘烤仪</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>硅O型圈</td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>25 mm 盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

记录人t淋巴细胞中钙释放激活钙（crac）电流的全细胞电生理技术

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

在T淋巴细胞中，细胞内Ca2+储存库的Ca2+耗竭会激活质膜上的Ca2+通道，这类通道被称为钙库操纵性钙（CRAC）通道。CRAC通道在调控T细胞增殖和基因表达中发挥重要作用。T细胞中CRAC通道功能异常与严重联合免疫缺陷病及自身免疫性疾病密切相关1, 2。研究人类T细胞中CRAC通道的功能，可能揭示调控正常免疫应答的新分子机制，并阐明相关人类疾病的病因。膜电流的电生理记录是评估通道功能特性及其调控机制最准确的方法。对Jurkat T细胞（一种人类白血病T细胞系）中CRAC通道电流的电生理记录最早于20多年前完成3，然而在正常人T细胞中记录CRAC电流仍是一项具有挑战性的任务。记录正常T细胞中CRAC通道电流的困难在于，来源于血液的T淋巴细胞体积远小于Jurkat T细胞，因此内源性的全细胞CRAC电流幅值非常低。本文中，我们提供了一种常规使用的分步操作流程，用于记录从健康志愿者外周血中分离的静息人T细胞中经CRAC通道介导的Ca2+或Na+电流。本方法借鉴了用于记录Jurkat T细胞及活化人T细胞中CRAC电流的已有实验流程4-8。

我们提供了一种用于记录外周血单个核细胞来源的人T淋巴细胞中钙释放激活钙（CRAC）电流的全细胞膜片钳技术的逐步实验方案。

记录人T淋巴细胞中钙释放激活钙（CRAC）电流的全细胞电生理技术

在T淋巴细胞中，细胞内钙库的Ca2+耗竭会导致质膜Ca2+通道的激活，这类通道称为钙释放激活钙通道……

钙释放激活的钙通道（CRAC通道），位于细胞质膜上，在T细胞增殖和基因表达中发挥重要作用。T细胞受体被抗原刺激后，会生成第二信使三磷酸肌醇（IP3），并经由三磷酸肌醇受体（IP3R）触发细胞内钙库中的钙释放。钙库内钙浓度降低，导致CRAC通道被激活，从而引起细胞质中钙离子浓度的继发性升高。T细胞中CRAC通道功能异常与多种人类疾病相关，包括严重联合免疫缺陷病和自身免疫性疾病。本文介绍了一种可对人T细胞内源性钙和钠裂解通道电流进行可靠且可重复记录的方法。首先，在无钙的细胞外溶液中加入三毫摩尔的镁，并应用FSA加林（FSA garin）——一种肌浆网/内质网钙ATP酶抑制剂，以耗竭钙库。该操作可打开裂隙通道，但由于裂隙通道对镁离子的通透性较差，因此不会引发裂隙电流。随后在T细胞膜上建立全细胞电压钳。细胞通过含有高浓度钙螯合剂pta的移液管溶液进行灌注。随后依次施加含钙或无二价阳离子的细胞外溶液，通过裂隙通道激活可测量的钙电流和钠电流。所得数据表明了静息状态下人T细胞中裂隙通道的功能性表达水平。通过裂隙通道研究膜电流可为裂隙通道的调控机制与功能提供重要信息，并阐明裂隙通道在正常免疫应答及免疫相关疾病中的作用。通常，由于人T淋巴细胞体积较小，且这些细胞中内源性裂解电流的幅度较低，初学者在使用该方法时可能会遇到困难。本实验所用的CD3阳性人T淋巴细胞取自健康志愿者的外周血样本，使用TEP人T细胞富集试剂盒和TEP密度介质进行分离。根据随附书面实验方案中的说明，细胞在37摄氏度的二氧化碳培养箱中，用T细胞培养基进行培养。配制以下溶液：溶液一，含有 3 毫摩尔/升镁离子，不含钙离子；溶液二，含有 20 毫摩尔/升钙离子；溶液三，含有 10 毫摩尔/升钙螯合剂 H-E-D-T-A，且不含二价离子；灌注溶液，含有 12 毫摩尔/升钙螯合剂 bta。将上述溶液在 4 摄氏度条件下保存，最多可保存一周。实验当天，使用玻璃毛细管和拉管仪拉制尖端直径约为 2 微米的移液管。使用带纤维丝的石英毛细管，其规格如文中所示并列于附带文本中。拉制后的移液管尖端需涂覆 PEC R 61 0 1 半导体保护涂层，并进行火焰抛光。将其存放于防尘处，例如移液管架中。打开此处控制膜片钳放大器的软件。E PC 10 膜片钳放大器由 Pulse 软件控制。配置并保存用于形成吉欧封接（giga seal）和建立全细胞记录模式的细胞附着及全细胞宏程序设置。接下来，在采集软件中配置并保存此处的刺激方案，以记录裂解电流。在脉冲生成窗口中，采集协议设置为持续 50 毫秒、从 -120 到 +100 毫伏的电压斜坡。创建两个刺激方案，分别设置为 0.5 赫兹和 5 赫兹的斜坡电压刺激频率，并在脉冲生成窗口中将其分别命名为 ramp one 和 ramp two。为准备记录，将含有 20 万至 50 万个细胞的 500 微升细胞悬液接种到记录室中，记录室由涂有聚赖氨酸的盖玻片和附着的硅胶 O 形圈组成。在 37 摄氏度下孵育 20 分钟。孵育结束后，将记录室固定在记录室支架中。此处使用的是自制的记录室支架，其底座部分支撑记录室底部的盖玻片，顶部部分则压紧盖玻片上端。将记录室支架置于倒置显微镜载物台上，使用40倍油镜和明场照明进行观察。找到一片细胞区域并调焦。将银/氯化银参比电极插入浴液中。然后调整多通道重力驱动灌流系统的对位，将进液管尖端以45度角置于接近视野区域的盖玻片附近，同时将吸液管插入到灌流 chamber holder 的上部。旋转腔室支架的上部，直至吸管与流入管相对，以实现正确的通道连接。通过打开灌流系统的阀门，开始记录电流，用不含钙、含3毫摩尔镁的bat溶液一号灌流记录腔室，该溶液中添加0.5至1微摩尔AP氩气，持续8到10分钟，以阻断circa泵。此步骤用于耗竭钙库。接下来，使用 einor 微量加样器配合 P 20 空气置换移液器。为将移液溶液装入移液器，请将移液器插入放大器头部支架上的固定座中。将自制的压力-负压装置连接至加压空气和真空管路。为在膜片钳电极内产生正压或负压，通过连接管将电极连接至压力-负压装置的出口，使电极内部施加约3英寸水柱的微小正压。点击计算机屏幕上EPC 10膜片钳窗口中的“setup”控制键。执行设置宏。在显微镜的示波器窗口中，通过视觉控制找到一个大小适中、外表面光滑且牢固贴附于盖玻片上的圆形细胞。然后将膜片电极在视觉监控下缓慢浸入浴液中。将移液管浸入浴液后，可以观察到流经移液管的电流。通过实验装置宏施加的5毫伏电压测试脉冲，会引发电流幅度的阶跃式变化。脉冲软件会自动计算移液管电阻，并将其显示在膜电阻窗口中。在计算机屏幕上，移液管的电阻通常为五到六兆欧。点击计算机屏幕放大器窗口中的自动控制键，以校正移液管与参考电极之间产生的偏移电位。基线电流将移动至零电流水平。使用显微操作器将移液管尖端移至接触细胞膜。一旦接触形成，测试脉冲所诱发的电流幅度将减小。对膜片移液管施加20至40英寸水柱的负压。在示波器窗口中监测吉欧封接的形成。随着移液管电阻值增加至五吉欧以上，测试脉冲所引发的电流幅度应逐渐减小。通常吉欧封接会快速形成，但也可能需要一到两分钟才能获得稳定的吉欧封接。一旦形成吉格封接，通过拔出连接管以断开移液管 holder 与压力吸引装置的连接。点击计算机屏幕上的“onsell 控制键”以执行实验前已设定好的 onsell 宏程序。根据 EPC 10 手册，通过点击 cfat 窗口中的自动控制键来补偿移液管的电容。在示波器窗口中，电流瞬变将消失，电极电容的数值将显示在 cfat 窗口中。为击破细胞膜，在电极内部，通过连接管将电极与一个 20 立方厘米的注射器相连，并向后拉动活塞，以对电极施加额外的负压。当电极内的细胞膜破裂时，将出现两个电流瞬变，使细胞膜充电至新的电压水平。点击计算机屏幕上的全细胞控制键，以执行预设的全细胞宏程序。然后，在V膜窗口中将钳制电位设置为+30毫伏，正的钳制电位有助于防止钙依赖性裂解通道的激活。接下来，点击C慢窗口中的自动控制键。在示波器窗口中补偿细胞电容后，电流瞬变将消失。细胞电容和串联电阻的数值将分别显示在 C slow 和 R series 窗口中。串联电阻通常在 7 到 20 兆欧范围内。对应于细胞电容值的 C slow 数值通常在 1.5 到 2.5 皮法范围内。在静息的人T细胞中，点击示波器窗口中的斜坡一控制键，以施加频率为0.5赫兹的一系列电压斜坡。这将执行在实验前于示波器窗口中生成并保存的刺激方案。由电压斜坡诱发的电流将被显示并记录。这些电流痕迹来自含有3毫摩尔镁的无钙溶液一。在此溶液中，由于镁对裂解通道的通透性较差，裂解电流非常小。在后续分析中将这些痕迹用作漏电流。在负100毫伏时，漏电流的绝对振幅应等于或小于5 pA。如果细胞漏电，则停止实验，更换新的膜片电极和新的细胞重新开始。接下来，通过切换灌流阀，将灌流液一号替换为含有20毫摩尔钙的灌流液二，以记录经由裂孔通道的钙电流。这使得钙离子能够经由裂孔通道流动，并在示波器窗口中产生内向电流。经由裂孔通道的内向整流钙电流在负电压下形成电流幅度，并由于钙依赖性对裂孔电流的增强作用，电流幅度在约一分钟内持续增加。单击示波器窗口中的“ramp two”控制键，以执行预设的刺激程序，该程序通过电压斜坡将刺激频率逐步增加5赫兹，有助于通过CRAC通道记录瞬时性的最大钠离子电流。接下来，在示波器窗口中再次切换灌流阀，将浴液2更换为含钠的无双价阳离子溶液3。此时，通过CRAC通道将出现一个瞬时的、幅度更大的内向整流性钠离子电流。实验结束后，关闭文件，保存记录的电流轨迹以供进一步分析。将保存的电流记录导入分析软件中。此处使用 Pulse 软件，在 Pulse 程序的示波器窗口中通过成对光标进行分析。在此处电压斜坡的起始点和终点测量电流幅度。在负100毫伏和正100毫伏下测量电流幅值。将电流幅值数据导出至图形处理软件，例如Origin科学绘图与分析软件。为进一步分析和图形化展示，采用本方法测量了来自一名健康人类受试者的CD3阳性静息T细胞中的裂解电流。本图显示了在全细胞电压钳制模式下记录的裂解电流的时间过程，其中实心圆圈表示负100毫伏下的记录值，空心圆圈表示正100毫伏下的记录值。在形成吉伽封接之前，细胞在无钙、含3毫摩尔镁的浴液一号中预孵育约10分钟，该溶液含有0.5微摩尔正磷酸盐。之后依次施加以下溶液：无钙、含3毫摩尔镁的浴液一号，随后是含20毫摩尔钙的浴液二号，接着是无双价阳离子的浴液三号，最后再次施加含20毫摩尔钙的浴液二号。细胞接受一系列从-120毫伏至+100毫伏的电压斜坡刺激，如图所示。每200毫秒或以5赫兹的频率在无双价阳离子的bat溶液三中施加电压斜坡，而在所有其他溶液中每2秒或以0.5赫兹的频率施加。注意，在施加含20毫摩尔钙的bat溶液二后，通过裂隙通道的钙电流缓慢发展；而在无双价阳离子的bat溶液三中，通过裂隙通道的钠电流则快速瞬时发展。该图显示了在无钙条件下电压斜坡期间记录的代表性电流轨迹。含有3毫摩尔镁的浴液一号、含有20毫摩尔钙的浴液二号，以及无二价阳离子的浴液三号。通过从含有20毫摩尔钙的浴液二号中记录的电流减去在无钙、含有3毫摩尔镁的浴液一号中记录的电流，以及从无二价阳离子的浴液三号中记录的电流，可以获得各个电压斜升过程中的钙电流和钠电流轨迹。所得电流轨迹显示了经由裂解通道（crack channels）介导的钙电流和钠电流典型的电流-电压关系，如图所示。一旦掌握该技术并正确完成实验的各个步骤，每天可记录五到十个细胞的裂孔膜片电流。观看本视频后，您应能够充分理解如何在静息状态下的人T细胞中记录校正电流。按照本方案操作，您还应能够记录免疫系统中其他细胞的正确电流，例如活化的人T细胞、单核细胞、巨噬细胞以及各种细胞系。电生理学。记录免疫系统细胞中裂解通道电流可能使研究人员能够确定其在免疫细胞钙稳态中的作用。

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在人T淋巴细胞的全细胞钙释放激活的钙记录（CRAC）的电流

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