Name: 在人T淋巴细胞的全细胞钙释放激活的钙记录（CRAC）的电流 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: 学习在人T淋巴细胞中使用全细胞膜片钳技术记录钙释放激活钙电流的方法。该方案利用FSA garin阻断SERCA泵以耗竭钙库，从而可靠地测量CRAC通道的内源性钙电流和钠电流，为研究T细胞钙信号传导及免疫相关疾病提供重要工具。

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我们感谢加利福尼亚大学戴维斯分校生理学与膜生物学系为我们提供了研究离子通道所需的设施和优良环境。

1. 静息人T淋巴细胞的制备
<ol>
 <li>使用 RosetteSep 人 T 细胞富集试剂和 RosetteSep 密度介质，根据制造商说明书从人血液样本中纯化 T 细胞。所得细胞群体应包含 95% CD3+ 静息 T 细胞。我们依据加州大学戴维斯分校机构审查委员会批准的方案，从健康志愿者外周血样本中纯化人 T 淋巴细胞。</li>
 <li>分离后，将静息 T 细胞重悬于细胞培养基中，细胞密度为 0.5 x 106 细胞/mL，培养基成分为含谷氨酰胺和 HEPES 的 RPMI-1640 培养基，并添加 10% 胎牛血清、2% GlutaMAX-I、1% RPMI 1640 维生素溶液、1% RPMI 1640 氨基酸溶液、1% 丙酮酸钠和 0.03% β-巯基乙醇。</li>
 <li>将细胞悬液置于细胞培养瓶中，在 37°C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育，实验前最多可维持 24 小时。</li>
</ol>
2. 记录室的制备
<ol>
 <li>制备记录室所需材料如下：a) 硅胶O形圈，b) 经70%乙醇和蒸馏H2O清洗的圆形25 mm盖玻片，c) 按照生产商说明配制的混合Sylgard184，以及d) 两个60 × 15 mm的培养皿。</li>
 <li>将约0.5 mL混合Sylgard184加入一个60 × 15 mm培养皿中。</li>
 <li>使用镊子将O形圈的底部浸入Sylgard184中。</li>
 <li>将O形圈置于洁净表面（如另一个培养皿）上，去除其边缘多余的Sylgard184。</li>
 <li>将O形圈放置在盖玻片上并压紧。</li>
 <li>通过在85°C下加热40–60分钟或直至Sylgard184完全聚合，使其固化。</li>
 <li>将记录室存放于无尘容器中。</li>
</ol>
3. 制备膜片钳电极
<ol>
 <li>实验当天，使用玻璃毛细管和拉管仪拉制尖端直径约为 2-μm 的移液管。我们采用带细丝的硼硅酸盐玻璃管（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm）。将移液管存放于无尘环境中。</li>
 <li>根据标准操作流程9，使用Sylgard184或HIPEC R6101半导体保护涂层对移液管尖端进行包被。</li>
 <li>实验前轻轻进行火焰抛光处理。</li>
</ol>
4. 膜片钳装置准备
<ol>
 <li>在控制膜片钳放大器的软件中配置并保存用于形成千兆欧封接的宏。我们使用由 Windows XP 和 Pulse 软件支持的 EPC-10 放大器进行数据采集。我们根据 EPC-10 手册设置"建立"、"细胞贴附"和"全细胞"宏，并将其用于所有实验。</li>
 <li>按照表1列出的成分配制浴液和移液管溶液，并在实验前将其储存于 4° C 长达1周。</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>化学试剂</td>
 <td colspan="3">灌流液（mM）</td>
 <td>电极内液（mM）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td># 1</td>
 <td># 2</td>
 <td># 3</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
 <tbody>
 <tr>
 <td>CH3SO3Na</td>
 <td>130</td>
 <td>110</td>
 <td>125</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>2</td>
 <td>4</td>
 <td>5</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ca(OH)2</td>
 <td>-</td>
 <td>20</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2</td>
 <td>3</td>
 <td>1</td>
 <td>-</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>10</td>
 <td>15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEDTA</td>
 <td>-</td>
 <td> </td>
 <td>10</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>1</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cs-aspartate</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>125</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAPTA</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>-</td>
 <td>12</td>
 </tr>
<tr>
<td>葡萄糖</td>
<td>10</td>
<td>10</td>
<td>10</td>
<td>-</td>
</tr>
 </tbody>
</table>
表1. 全细胞CARC电流记录用溶液。
所有化学品均购自 Sigma-Aldrich，St. Louis, MO。
<ol start="3">
 <li>测定膜片钳电极液与每种灌流液之间的液接电位（LJ）10。使用数据采集软件将LJ值保存在适当位置。例如，在Pulse程序中，将LJ值输入“放大器”窗口中的“LJ”控制项。</li>
 <li>在实验开始前，按照图1所示，在数据采集软件的适当位置配置并保存刺激方案。在Pulse程序中，我们在“脉冲生成”窗口中设置采集协议。 <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="电压钳方法示意图，显示膜电位在 -120 mV、30 mV 和 100 mV 的阶跃变化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 刺激方案。 每0.2 - 2秒（5 - 0.5 Hz）施加一次持续50毫秒的电压斜坡，从-120 mV升至+100 mV。斜坡之间的钳制电位（Vh）维持在+30 mV。</li>
</ol>
5. 将细胞固定在显微镜载物台上
<ol>
 <li>用多聚赖氨酸（poly-L-lysine）包被记录室约 20 分钟，然后用 H2O 洗涤，再用 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）洗涤，之后接种细胞。</li>
<li>将含有 0.2–0.5 × 106 个细胞的 500 μL 细胞悬液接种至记录室中，并在 37°C 下孵育 20 分钟。</li>
<li>将带有贴壁细胞的记录室固定于记录室支架中。我们使用定制的记录室支架，其底部支撑盖玻片的下方，而上部则轻轻压住盖玻片的上方。</li>
<li>将记录室支架置于倒置显微镜的载物台上。</li>
<li>在透射光下对细胞进行调焦。我们使用 40X 油浸物镜。</li>
<li>将 Ag/AgCl 参比电极插入浴液中。</li>
<li>校准多通道重力驱动灌流系统。进液管的尖端应以 45° 角靠近视野区域放置于盖玻片附近。</li>
<li>将吸液管置于进液管尖端的对侧位置。</li>
<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）或 HBSS 对记录室进行灌流，以洗去细胞培养基及未牢固贴附的细胞。</li>
</ol>
6. CRAC 通道电流记录
<ol>
 <li>找到一个牢固贴附在盖玻片上的细胞。我们通常选择大小适中、呈圆形且表面光滑的细胞。 </li>
 <li>用含钙溶液灌注记录室2+无镁，3 mM Mg2+含浴液 #1（表 1），其中含有 0.5-1 μM 使用毒胡萝卜素（thapsigargin）处理 8-10 分钟，以阻断 SERCA 泵。此步骤旨在形成吉欧密封（gigaseal）前耗尽细胞内钙库。 </li>
 <li>使用 Eppendorf 微量移液器和 P-20 移液枪，将电极内液（表 1）注入记录电极中，并将记录电极插入放大器头部的电极夹持器内。Ca2+ 螯合剂BAPTA被加入到移液管溶液中，以被动耗竭钙库并降低Ca2+依赖性CRAC通道失活</li>
 <li>施加少量正压（约3英寸水柱）2O）在进入浴液之前，使用定制的压力-吸力装置连接加压空气和真空管路，以在膜片钳电极内产生正压或负压。 </li>
 <li>在显微镜下通过视觉控制将记录电极移入浴液中。在“示波器”窗口中，应观察到有电流流经电极。此时，预设宏程序施加的小幅度电压脉冲（测试脉冲）应引起电流幅度的阶跃式变化。由此可测定电极电阻值。本实验所用电极的电阻通常为5–6 MΩ。</li>
 <li>校正移液管与参比电极之间产生的“零点”电位。</li>
 <li>在显微镜的视觉控制下，将移液器尖端靠近细胞，直至接触细胞膜。</li>
 <li>施加负压（20–40 英寸 H₂O）2O）置于膜片移液管内。 </li>
 <li>在“示波器”窗口中监测千兆欧姆封接的形成。您将观察到由测试脉冲引起的电流幅度减小，同时移液管电阻值上升至 &gt;5 GΩ。通常在几秒内形成吉欧姆封接，但可能需要1-2分钟才能获得稳定的吉欧姆封接。</li>
 <li>补偿移液器电容（“C-Fast”）。 </li>
 <li>使用20 ml注射器施加额外负压以击破膜片。</li>
 <li>将钳制电位设置为 +30 mV。正的钳制电位有助于防止钙依赖性的CRAC通道失活。</li>
 <li>补偿细胞的膜电容（“C-slow”）；保存或记录C-slow的数值。 </li>
 <li>检查接入电阻“R”的数值s。在我们的实验中，Rs 通常为 7-20 MΩ。</li>
 <li>以0.5 Hz的频率开始施加一系列电压斜坡（图1）至Ca2+不含 3 mM Mg2+含浴液 #1。在此溶液中，由于CRAC通道对Mg的通透性较差，CRAC电流相较于“漏”电流可忽略不计2+保存并将在灌流液#1中记录的当前轨迹用于后续分析，作为“漏”电流。在-100 mV时，“漏”电流的绝对幅值应小于或等于5 pA。若细胞“漏电”，则终止实验，更换新的膜片钳电极和新的细胞重新开始。</li>
 <li>为了记录 Ca2+ 通过CRAC通道的电流（ICa-CRAC), 替换 Ca2+无镁 3 mM Mg2+含20 mM Ca的浴液#12+-通过切换灌流阀，更换为含浴液#2（表1），以实现Ca2+ 通过CRAC通道流动并产生内向电流。在“示波器”窗口中，您将观察到内向整流I的形成过程。Ca-CRAC （图2）。由于Ca，在负电压下的电流幅度将在约1分钟内持续增加2+依赖性CRAC电流增强</li>
 <li>以电压梯度将刺激频率增加至 5 Hz，这是记录瞬时 Na+ 通过CRAC通道的电流</li>
 <li>更换 20 mM Ca2+含 Na 的浴液 #2+-通过切换灌流阀，更换为无双价阳离子溶液 #3（表 1）。在“示波器”窗口中，您将观察到幅值较大的瞬时内向整流 Na+ 通过CRAC通道的电流（INa-CRAC；图2）。</li>
 <li>可加入 20 mM Ca2+含浴液 #2，含 1-5 μM La3+ 实验结束时记录“漏电流”。然而，我们发现这种方法并不实用，因为“漏电流”会随时间变化，实验结束时可能变大或变小。我们更倾向于采用在 Ca 记录的电流2+不含 3 mM Mg2+实验开始时，将含浴液 #1 的电流作为“漏电流”进行记录。</li>
 <li>保存记录的电流轨迹，以供进一步分析。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
 <li>将保存的电流记录导入分析软件。我们使用 Pulse 程序进行分析。</li>
 <li>测量电压斜坡起始和结束时的电流幅度。我们通常在 Pulse 程序的“示波器”窗口中使用成对光标，测量 -100 mV 和 +100 mV 时的电流幅度。</li>
 <li>将电流幅度值导出至图形处理软件，用于进一步分析和图形呈现。我们使用 Origin 科学绘图与数据分析软件（版本 7）。</li>
</ol>
8. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="显示离子电流（I）与膜电压（Vm）分析的电生理学实验示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 静息人 T 细胞中的 CRAC 电流。 （A），在全细胞电压钳制模式下于 -100 mV（实心圆）和 +100 mV（空心圆）记录的 CRAC 电流的时间过程。在形成吉欧封接（gigaseal）之前，细胞在含 3 mM Mg2+ 的无 Ca2+ 浴液 #1 中预孵育约 10 分钟，该溶液含有 0.5 μM 毒胡萝卜素（thapsigargin）。破膜后，依次施加以下浴液：含 3 mM Mg2+ 的无 Ca2+ 浴液 #1（0 Ca + 3 Mg），随后为含 20 mM Ca2+ 的浴液 #2（20 Ca），接着为无二价阳离子的浴液 #3（DVF），最后再回到浴液 #2（20 Ca）。细胞受到如图 1 所示的一系列电压斜坡刺激。在浴液 #3（DVF）中，斜坡频率为 5 Hz，而在所有其他溶液中为 0.5 Hz。注意在施加含 20 mM Ca2+ 的浴液 #2 后 ICa-CRAC 的缓慢发展，以及在 DVF 浴液 #3 中 INa-CRAC 的快速瞬时发展。（B），在含 3 mM Mg2+ 的无 Ca2+ 浴液 #1（“漏电流”）、含 20 mM Ca2+ 的浴液 #2（20 Ca）以及浴液 #3（DVF）中电压斜坡期间记录的代表性电流轨迹。（C, D），通过从含 20 mM Ca2+ 的浴液 #2（20 Ca）和浴液 #3（DVF）中记录的电压斜坡电流中减去“漏电流”所获得的 ICa-CRAC（C）和 INa-CRAC（D）的电流-电压关系，如图（B）所示。

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在静息人T细胞中进行CRAC电流的电生理学研究是一项具有挑战性的任务，因为这些细胞的内源性CRAC电流幅值较小，其原因是细胞尺寸小（静息人T细胞的直径范围为5-8 μm）。本文中，我们提供了一种逐步操作流程，用于可靠地记录从外周血单个核细胞中分离出的静息人T淋巴细胞中的CRAC电流。该技术使我们能够研究静息T细胞中CRAC通道的生理特性及功能表达，从而更深入地理解正常与病理状态下免疫细胞反应的本质。利用本实验方案，不仅可以检测静息人T细胞中的CRAC电流，还可用于其他免疫细胞，如活化人T细胞、单核细胞和巨噬细胞中的CRAC电流测量。

<table><tbody><tr><td>人T细胞富集鸡尾酒试剂 RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep 密度介质</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>含谷氨酰胺/HEPES的RPMI 1640培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I（100倍溶液）</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 维生素溶液（100倍）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>1640 氨基酸溶液（50倍）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸肌醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>氯化镧</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>毒胡萝卜素（Thapsigargin）</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>HIPEC R6101 半导体防护涂层</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63-500 系列高性能隔振实验台</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>EPC 10 膜片钳放大器及前置放大头级</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>配备40倍油镜的奥林巴斯IX71倒置显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Windows 计算机</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulse 软件</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 科学绘图与分析软件</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>膜片钳移液电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>含丝硼硅酸盐玻璃（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm）</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Narashige&amp;rsquo;s 微电极烘烤仪</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>硅O型圈</td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>25 mm 盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

记录人t淋巴细胞中钙释放激活钙（crac）电流的全细胞电生理技术

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

在T淋巴细胞中，细胞内Ca2+储存库的Ca2+耗竭会激活质膜上的Ca2+通道，这类通道被称为钙库操纵性钙（CRAC）通道。CRAC通道在调控T细胞增殖和基因表达中发挥重要作用。T细胞中CRAC通道功能异常与严重联合免疫缺陷病及自身免疫性疾病密切相关1, 2。研究人类T细胞中CRAC通道的功能，可能揭示调控正常免疫应答的新分子机制，并阐明相关人类疾病的病因。膜电流的电生理记录是评估通道功能特性及其调控机制最准确的方法。对Jurkat T细胞（一种人类白血病T细胞系）中CRAC通道电流的电生理记录最早于20多年前完成3，然而在正常人T细胞中记录CRAC电流仍是一项具有挑战性的任务。记录正常T细胞中CRAC通道电流的困难在于，来源于血液的T淋巴细胞体积远小于Jurkat T细胞，因此内源性的全细胞CRAC电流幅值非常低。本文中，我们提供了一种常规使用的分步操作流程，用于记录从健康志愿者外周血中分离的静息人T细胞中经CRAC通道介导的Ca2+或Na+电流。本方法借鉴了用于记录Jurkat T细胞及活化人T细胞中CRAC电流的已有实验流程4-8。

我们提供了一种用于记录外周血单个核细胞来源的人T淋巴细胞中钙释放激活钙（CRAC）电流的全细胞膜片钳技术的逐步实验方案。

记录人T淋巴细胞中钙释放激活钙（CRAC）电流的全细胞电生理技术

在T淋巴细胞中，细胞内钙库的Ca2+耗竭会导致质膜Ca2+通道的激活，这类通道称为钙释放激活钙通道……

钙释放激活的钙通道（CRAC通道），位于细胞质膜上，在T细胞增殖和基因表达中发挥重要作用。T细胞受体被抗原刺激后，会生成第二信使三磷酸肌醇（IP3），并经由三磷酸肌醇受体（IP3R）触发细胞内钙库中的钙释放。钙库内钙浓度降低，导致CRAC通道被激活，从而引起细胞质中钙离子浓度的继发性升高。T细胞中CRAC通道功能异常与多种人类疾病相关，包括严重联合免疫缺陷病和自身免疫性疾病。本文介绍了一种可对人T细胞内源性钙和钠裂解通道电流进行可靠且可重复记录的方法。首先，在无钙的细胞外溶液中加入三毫摩尔的镁，并应用FSA加林（FSA garin）——一种肌浆网/内质网钙ATP酶抑制剂，以耗竭钙库。该操作可打开裂隙通道，但由于裂隙通道对镁离子的通透性较差，因此不会引发裂隙电流。随后在T细胞膜上建立全细胞电压钳。细胞通过含有高浓度钙螯合剂pta的移液管溶液进行灌注。随后依次施加含钙或无二价阳离子的细胞外溶液，通过裂隙通道激活可测量的钙电流和钠电流。所得数据表明了静息状态下人T细胞中裂隙通道的功能性表达水平。通过裂隙通道研究膜电流可为裂隙通道的调控机制与功能提供重要信息，并阐明裂隙通道在正常免疫应答及免疫相关疾病中的作用。通常，由于人T淋巴细胞体积较小，且这些细胞中内源性裂解电流的幅度较低，初学者在使用该方法时可能会遇到困难。本实验所用的CD3阳性人T淋巴细胞取自健康志愿者的外周血样本，使用TEP人T细胞富集试剂盒和TEP密度介质进行分离。根据随附书面实验方案中的说明，细胞在37摄氏度的二氧化碳培养箱中，用T细胞培养基进行培养。配制以下溶液：溶液一，含有 3 毫摩尔/升镁离子，不含钙离子；溶液二，含有 20 毫摩尔/升钙离子；溶液三，含有 10 毫摩尔/升钙螯合剂 H-E-D-T-A，且不含二价离子；灌注溶液，含有 12 毫摩尔/升钙螯合剂 bta。将上述溶液在 4 摄氏度条件下保存，最多可保存一周。实验当天，使用玻璃毛细管和拉管仪拉制尖端直径约为 2 微米的移液管。使用带纤维丝的石英毛细管，其规格如文中所示并列于附带文本中。拉制后的移液管尖端需涂覆 PEC R 61 0 1 半导体保护涂层，并进行火焰抛光。将其存放于防尘处，例如移液管架中。打开此处控制膜片钳放大器的软件。E PC 10 膜片钳放大器由 Pulse 软件控制。配置并保存用于形成吉欧封接（giga seal）和建立全细胞记录模式的细胞附着及全细胞宏程序设置。接下来，在采集软件中配置并保存此处的刺激方案，以记录裂解电流。在脉冲生成窗口中，采集协议设置为持续 50 毫秒、从 -120 到 +100 毫伏的电压斜坡。创建两个刺激方案，分别设置为 0.5 赫兹和 5 赫兹的斜坡电压刺激频率，并在脉冲生成窗口中将其分别命名为 ramp one 和 ramp two。为准备记录，将含有 20 万至 50 万个细胞的 500

whole-cell-recording-calcium-release-activated-calcium-crac-currents

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在人T淋巴细胞的全细胞钙释放激活的钙记录（CRAC）的电流

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

本视频分析T细胞受体诱导的T细胞内钙离子流入。抗CD3抗体激活T细胞信号通路，导致细胞内钙离子浓度升高，钙离子与Indo-1染料结合。在流式细胞术中，光谱从无钙状态向钙结合状态的偏移 反映了T细胞受体诱导的钙离子内流。...

利用钙离子指示剂染料评估T细胞受体诱导的钙离子内流

我们描述了一种可用于结合细胞内Ca2+浓度测量与电生理膜片钳研究的人类心房肌细胞的分离方法。...

人房颤肌细胞的分离以同时测量Ca2+瞬变和膜电流

本文描述了同时记录膜电位或电流以及细胞内钙离子浓度变化的方法。通过全细胞膜片钳配置的膜片钳电极，将钙离子指示剂bis-fura-2导入视交叉上核神经元中。...

同时记录视交叉上核神经元的电生理活动与钙成像

在突触前释放面膜上记录 Ca2+ 电流，对于精确理解 Ca2+...

急性分离七鳃鳗网状脊髓轴突以实现对单个功能性突触前终末释放面膜的记录

本文介绍了利用荧光显微镜对加载了Ca2+指示剂的完整哺乳动物细胞中由IP3介导的局部Ca2+事件进行成像的技术，并提供了一种可自动识别和分析这些事件的算法。...

培养的哺乳动物细胞中局部 Ca2+ 信号的成像

小鼠模型可用于研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞以进行膜片钳测量。本文介绍了一种通过逆行酶解Langendorff灌流法分离小鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法可实现钙瞬变与L型钙电流的同步记录。...

分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

本文描述了用于研究在EB病毒永生化的人B淋巴细胞以及由肌肉活检获得的卫星细胞分化成的肌管细胞中内源性表达的RYR1突变功能效应的方法。...

内源性表达的人源RYR1变异体的功能表征

钙离子内流是T细胞信号传导的指标，可用于有效分析T细胞受体刺激后的反应。该方案利用全光谱流式细胞术高度灵活的检测能力，将Indo-1与针对细胞表面分子的多色抗体组合进行多重检测。...

通过全光谱流式细胞术分析原代小鼠T细胞中T细胞受体诱导的钙离子内流

本文提供了一种全面的实验方案，利用荧光显微镜检测原代小鼠和人T细胞中的初始局部Ca2+信号（即Ca2+微区）。该方案可为研究免疫细胞内Ca2+信号通路及其功能的科研人员提供重要参考。...

成像初始Ca2+微区在原代T细胞中的研究

本文介绍了一种利用Fura-2/AM染料进行单细胞Ca2+成像，实时定量监测细胞内钙离子（Ca2+）浓度的方法。该技术可实现高效的染料加载，并通过荧光强度比值准确计算Ca2+水平，是一种简便、快速适用于科研应用的技术方法。...

单细胞钙成像用于研究钙离子通道的激活

学习在人T淋巴细胞中使用全细胞膜片钳技术记录钙释放激活钙电流的方法。该方案利用FSA garin阻断SERCA泵以耗竭钙库，从而可靠地测量CRAC通道的内源性钙电流和钠电流，为研究T细胞钙信号传导及免疫相关疾病提供重要工具。

记录人T淋巴细胞中钙释放激活钙（CRAC）电流的全细胞电生理技术

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