大脑和脊髓的单核细胞的分离，使用Percoll梯度
2011年2月2日
本文介绍一个快速的协议，有效地从大脑和脊髓组织，可以有效地利用流式细胞仪分析中分离出的单个核细胞。
免疫细胞在感染、创伤、自身免疫或神经退行性变期间浸润中枢神经系统。虽然组织化学方法可用于确定浸润细胞的位置并分析相关病理，但这些技术受到可同时使用的抗体数量的限制。这里展示了一种从脑和脊髓组织中快速分离单核细胞的方法，其中解剖的组织首先被匀浆。
接下来，设置 perol 梯度，离心后，从界面收集单核细胞。最后，冲洗细胞并用抗体染色 通过流式细胞术分析，区分血源性细胞和监测小胶质细胞，并确定它们在疾病状态下的相对比例。与现有方法（如 Aris 梯度）或此类组织化学相比，该技术的主要优点是耗时更少。
这使您可以同时处理更多组织。演示梯度设置将是 palino 我实验室的一名技术人员准备此方案所需的试剂。从每脑 4 毫升等渗 perol 开始，称为 SIP。
为此，将 9 份 perol 与 1 份 10 倍 HBSS 混合，不经钙和镁倒置混合。接下来，每次通话准备 70%，同时将准备好的 SIP 与不含钙和镁的 1 倍 HBSS 混合。然后将 2 毫升 70%/凉拌管分配到 15 毫升聚丙烯锥形管中以收集组织。
对于此程序，将所有研究小鼠的解剖大脑和脊髓放入含有 10 毫升 RPMI 的烧杯中，加冰。接下来，将组织转移到 7 或 15 毫升的羽绒匀浆器中，该匀浆器含有 3 毫升 1 倍 HBSS 且具有松散配合尺寸的匀浆。杵轻轻地制成细胞悬液，然后切换到紧密贴合的 B 号杵，并进一步解离组织。
组织匀浆后，加入 RPMI 或一倍 HBSS 至最终体积为 7 毫升，然后继续设置梯度以设置 percoco 梯度。首先向细胞悬液中加入 3 毫升 SIP，最终 PERCOCO 浓度为 30%请记住，perol 应在室温下使用。如果冷用，细胞容易结块，细胞分离效率较低。
接下来，使用我们的移液器辅助设置重力模式，将 10 mL 细胞悬液缓慢分层于 70% SIP 的顶部。避免混合 70% 和 30% 溶液。这是该程序中最关键的一步。
在 70% 到 30% 的交界处应该可以看到一条非常清晰的平线。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为第三种和 70% 溶液会在分层过程中混合。下一步，破坏界面 在 30 摄氏度下以 500 Gs 离心 18 分钟。
确保离心机以最少的中断或没有中断的方式停止，以免干扰界面。旋转梯度后，管顶部应积聚一层厚厚的粘性碎屑。下一层是每层芯层 30% 的淡黄色，有时包含碎片。
接下来是 70 到 30 界面，它应该有一个明确的白色光晕并包含单核细胞。最后，试管底部是透明的 70%perol 层。如果未观察到界面，则细胞的产量可能会非常低，从而使进一步分析变得极其困难。
因此，此时可能需要新鲜细胞悬液以减少污染。小心地去除试管顶部的碎屑层并将其丢弃。然后使用塑料移液管，通过每个核心层的顶部 30%，收集 2 到 3 毫升的 70 30 间相，并将其转移到含有 8 毫升 1 倍 HBSS 的干净锥形管中。
将稀释的界面倒置混合数次，然后在 18 摄氏度下以 500 GS 离心 7 分钟。旋转后，取出 supena 并重悬沉淀。在 1 毫升细胞染色缓冲液中，将细胞悬液转移到 1.5 毫升试管中，再洗涤一次。
在进行抗体染色进行抗体染色之前，使用 10， 000 GS 在 4 摄氏度下微量离心机 1 分钟进行抗体染色，将沉淀重悬于 50 微升纯化的抗 US CD 16、CD 32 中，在细胞染色缓冲液中稀释 1 至 200 以阻断 FC 结合位点。对于任何染色程序，必须充分滴定所有抗体，并在冰上孵育 10 分钟。在孵育过程中，取出 2 到 5 微升细胞，并使用血细胞计数器进行计数。
结合的幼稚脑组织和脊髓组织应产生大约三到五倍的 10 倍于每只小鼠的 5 个细胞。发炎的大脑将具有不同数量的炎症细胞，具体取决于收集它们的时间点和疾病模型 与 CD 16 和 CD 32 孵育后，加入 50 微升免疫细胞特异性抗体混合物。本例中使用的混合物包含抗 CD 45、CD 4 和 CD 19 的抗体，在冰上孵育 30 分钟。
重要的是，每种抗体都必须首先进行滴定。为了评估最佳稀释度，请使用根据激光能力和特定流式过滤器设置选择的适当荧光染料组合。细胞计数器，细胞染色后，加入 1 毫升细胞染色缓冲液，在细胞染色缓冲液中洗涤细胞，并旋转 1 分钟。
离心后 10， 000 Gs 丢弃仰卧位试剂，然后将托盘重悬于 100 至 200 μL 细胞染色缓冲液中，以便立即进行流式细胞分析，以便以后分析。Reus 将细胞悬浮在 PBS 中制备的 2% par 甲醛中，并在 4 摄氏度下储存过夜。此处显示的是获得并与 FC 阻断一起孵育的单核细胞，然后是抗 CD 45、CD 4 和 CD 19 抗体。
根据流式细胞术证明的方案，CD 45 染色很好地将 CD 45 高位血细胞与 CD 45、DIM 监测小胶质细胞分开。该图比较了从幼稚细胞和小鼠诱导发生实验性自身免疫性脑脊髓炎的发炎大脑中分离的细胞。CD 45 A PC 强度显示在 Y 轴上，其中三个不同的群体在幼稚的大脑中可视化。
检测到极少量的 CD 45 高细胞。通常不到孤立人群总数的 2%。相比之下，受 EAE 影响的小鼠的大脑显示大量血细胞被募集到大脑中。
添加其他细胞表面标志物，如 CD 11 b、CD 4、CD 8 等，可以进一步表征 CD 45 高群体一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到四个小时内完成。在参加此程序时，重要的是要记住，组织学方法与流式细胞术免疫表型分析相结合，对于充分表征 CNS 炎性浸润的组成至关重要。
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概述
本文介绍了一种从脑和脊髓组织中分离单核细胞的快速方案，便于流式细胞术分析。该方法相比传统技术提高了效率。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 免疫细胞浸润发生在各种中枢神经系统疾病中。
- 组织化学方法在抗体使用方面存在限制。
- 流式细胞术允许对免疫细胞群进行详细分析。
- 快速分离技术可以提高研究效率。
研究目的
- 开发一种从中枢神经系统组织中快速分离单核细胞的方法。
- 实现对这些细胞的有效流式细胞术分析。
- 在疾病状态下区分造血细胞和小胶质细胞。
使用的方法
- 脑和脊髓组织的解剖和均质化。
- 设置Percoll梯度以分离细胞。
- 离心收集单核细胞的界面。
- 用抗体对细胞进行冲洗和染色以用于流式细胞术。
主要结果
- 实现了单核细胞的有效分离。
- 流式细胞术允许对细胞群进行分析。
- 确定了疾病状态下免疫细胞的相对比例。
- 该方法比现有技术耗时更少。
结论
- 该快速分离方案对流式细胞术分析有效。
- 该技术可以增强对中枢神经系统免疫反应的研究。
- 未来研究可以受益于该方法的提高效率。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of CNS-infiltrating mononuclear cells is critical for de-risking neuroinflammation targets and enabling high-confidence immune phenotyping in neurodegenerative and autoimmune disease models. This protocol supports rapid, reproducible preparation of brain and spinal cord immune cell suspensions, directly impacting early discovery and translational research pipelines. By facilitating robust flow cytometry-based characterization, it enhances predictive confidence and portfolio triage for CNS-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell infiltration mechanisms in CNS disease models.
- Supports functional target validation by distinguishing hematogenous cells from resident microglia.
- Provides quantitative immune cell composition data for mechanistic de-risking.
- Facilitates portfolio triage by clarifying immune involvement in neuroinflammatory pathologies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated CNS-derived cell suspensions for downstream flow cytometry assays.
- Standardizes immune cell isolation, improving reproducibility across studies and teams.
- Delivers quantitative outputs suitable for screening compound effects on immune cell populations.
- Enables scalable processing of multiple samples, supporting high-throughput workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune phenotyping with disease-relevant CNS models for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical validation of neuroimmune targets.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust immune cell readouts.
- De-risks mechanistic hypotheses regarding CNS immune infiltration in disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery, target validation, and preclinical immune profiling in CNS research pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on immune cell infiltration and CNS pathology relationships.
- Screening: Provides reproducible, quantitative immune cell suspensions for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers flow cytometry-based measurements to compare immune cell populations across conditions.
- Translational Research: Connects immune phenotyping outputs to disease models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for CNS immune cell isolation across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and scalability of CNS immune cell isolation.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neuroinflammation portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS-targeted therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CNS tissue dissection and flow cytometry analysis.
- Needs access to centrifugation equipment and validated antibody panels.
- Demands cross-team standardization of gradient setup and antibody titration.
- Adaptable to both naive and inflamed CNS tissues, with yield variability based on disease state.
- Careful gradient layering and temperature control are critical for optimal cell recovery and purity.
