Name: 大脑和脊髓的单核细胞的分离，使用Percoll梯度 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习使用Percoll密度梯度离心法从小鼠脑和脊髓组织中快速分离单核细胞，并通过流式细胞术进行免疫表型分析。该方法可高效区分CD45高表达的造血细胞与CD45低表达的小胶质细胞，适用于研究中枢神经系统免疫浸润。

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本工作由美国国家多发性硬化症协会（TA 3021-A1/T，资助编号授予 AEC）和德克萨斯大学圣安东尼奥分校资助。

试剂的制备
通过将9份Percoll与1份不含Ca++和Mg++的10倍浓度HBSS混合，制备每脑4 ml的储备等渗Percoll（SIP）。
将SIP配制为不含Ca++和Mg++的1X HBSS中的70%溶液，每份2 ml分装至15 ml聚丙烯圆锥管中，每管对应一份脑组织。
注意：建议 Percoll 在室温下使用，如果在低温下使用，细胞容易聚集，导致细胞分离效率降低。
组织采集与匀浆化
麻醉小鼠，并通过左心室灌注冰冷的1× HBSS。解剖脑和脊髓，并将其置于不含酚红的RPMI培养基中，直至所有小鼠均被处死。
将组织置于含有 3 ml RPMI 的 7 或 15 ml Dounce 匀浆器中，先用松配合的研杵（A 型）轻轻制成细胞悬液，再用紧配合的研杵（B 型）进一步解离组织。用 RPMI 将细胞悬液补至 7 ml。
梯度设置
向细胞悬液中加入 3 ml SIP，使 SIP 终浓度为 30%
将10 mL细胞悬液缓慢地加至70% SIP上方。这是实验过程中最关键的一步，应使用设置为重力模式的移液器辅助装置，避免70%和30%溶液混合。在70%与30%溶液交界处应能观察到一条非常清晰的水平分界线。
在18°C条件下以500×g离心30分钟。确保离心机停止时使用最小或无刹车，以免干扰中间相。
使用移液管轻轻移除管顶部的碎片层，并将70%-30%界面层的2.0–3.0 ml收集至含有8 ml 1× HBSS的干净锥形管中。确保含有界面层的Percoll溶液被稀释约三倍，轻轻颠倒混匀数次，然后在18°C下以500×g离心7分钟。
将沉淀物重悬于1 ml细胞染色缓冲液中，转移至1.5 ml离心管，于4°C下以10,000G离心1分钟，再洗涤一次。
抗体染色
将沉淀重悬于50 μl细胞染色缓冲液中，其中含有1:200稀释的纯化抗小鼠CD16/CD32抗体，用于阻断Fc结合位点。冰上孵育10分钟。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
加入50 μl抗体混合液，在冰上孵育30分钟。每种抗体均需预先进行滴定，以确定最佳稀释比例。根据您所使用的流式细胞仪的激光器和滤光片配置，选择合适的荧光染料组合。
用细胞染色缓冲液洗涤细胞，将沉淀重悬于100–200 μl细胞染色缓冲液中，立即在流式细胞仪上进行分析；或者，也可将细胞重悬于PBS中配制的2%多聚甲醛（PFA）中，于4°C过夜保存。
代表性结果：
离心梯度后，70%-30% 介相应呈现清晰的白色环状结构，从未经处理的小鼠中回收的细胞数量通常为每只小鼠 3-5 × 105 个细胞（包括脑和脊髓）。炎症性脑组织中的炎性细胞数量可能因中枢神经系统损伤或疾病模型的不同而有所差异（图1）。
<img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="流式细胞术分析；正常与EAE脑组织细胞；散点图；CD45白细胞、小胶质细胞、分化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. 从正常小鼠和疾病高峰期EAE小鼠脑组织中分离单核细胞。脑组织细胞悬液通过不连续的70%/30% Percoll梯度离心进行分离。细胞染色时，先在冰上用Fc阻断剂孵育，随后加入抗CD45抗体，冰上孵育30分钟。细胞用细胞染色缓冲液洗涤，并在LSR-II流式细胞仪检测前用2%多聚甲醛固定。Y轴显示CD45荧光强度，可观察到三个不同的细胞群。通过使用其他特异性抗体进一步表征CD45hi浸润细胞的免疫表型，并随后通过流式细胞术进行分析。

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tickets+to+the+brain%3A+Role+of+CCR2+and+CX%283%29CR1+in+myeloid+cell+entry+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS.</a> J Neuroimmunol. , (2010).</li>
<li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li>
<li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain%2C+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

多年来，研究人员一直采用细胞表面标志物分析方法来研究正常和炎症小鼠组织中中枢神经系统（CNS）的白细胞1-3。细胞分离方案通常基于密度梯度离心法对小胶质细胞和白细胞进行分离4。本文介绍了一种利用不连续Percoll梯度快速高效分离CNS白细胞的方法。细胞分离后，可通过多种抗体（如但不限于CD45、CD4、CD8、CD11b、CD19等）染色，识别在特定病理条件下浸润中枢神经系统的免疫细胞群体。使用抗CD45抗体染色后，流式细胞术可鉴定出三个不同的细胞群：（1）CD45阴性群体，主要包括神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞及其他神经细胞；（2）CD45lo（低表达）或中间表达群体，主要为处于监视状态的小胶质细胞；（3）CD45hi（高表达）群体，主要由浸润的血液来源白细胞组成。研究髓系细胞在中枢神经系统病理过程中的作用一直具有挑战性。然而，结合多种细胞表面标志物5, 6以及骨髓嵌合小鼠模型的应用，已为理解髓系细胞在中枢神经系统炎症中的功能差异提供了重要线索2, 7, 8。通过髓鞘肽段免疫后，可诱导自身免疫反...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;组织匀浆与梯度分离&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;李&gt;Percoll (Amersham)&lt;/li&gt;&lt;李&gt;10X Hanks&amp;rsquo; 不含钙和镁的平衡盐溶液（Gibco）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;RPMI 1640 培养基，不含酚红（Gibco）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;7 ml 或 15 ml Dounce 组织研磨器（VWR）&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;流式细胞术&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;李&gt;细胞染色缓冲液（Biolegend）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭剂），BD Pharmingen&lt;/li&gt;&lt;李&gt;血细胞计数板（Fisher）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;抗小鼠 CD45（克隆 30-F11）、CD4（克隆 RM4-5）、CD19（克隆 6D5），BioLegend&lt;/li&gt;&lt;李&gt;不含钙和镁的10倍浓度磷酸盐缓冲液（Thermo Scientific）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;多聚甲醛（Sigma Aldrich）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;使用 LSR II（BD Biosciences）进行流式细胞术分析&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

使用percoll梯度分离脑和脊髓单个核细胞

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

在感染、创伤、自身免疫或神经退行性疾病过程中，通常需要分离浸润中枢神经系统（CNS）的免疫细胞，以明确其表型和效应功能。组织化学方法对于确定浸润细胞的定位以及分析相关的中枢神经系统病理变化具有重要作用。然而，原位组织化学和免疫荧光染色技术在单次实验中可使用的抗体数量有限，限制了对特定组织内免疫细胞亚群的表征。因此，结合组织学方法与流式细胞术进行免疫表型分析，对于全面表征局部中枢神经系统浸润细胞的组成至关重要。本方案基于通过非连续Percoll梯度分离中枢神经系统细胞悬液。本文介绍了一种快速分离脑和脊髓组织中单个核细胞的高效方案，所获得的细胞可用于单一样本中多种免疫细胞群体的流式细胞术鉴定。

本文介绍了一种快速分离脑和脊髓组织中单个核细胞的高效方案，所获细胞可有效用于流式细胞术分析。

使用Percoll梯度分离脑和脊髓单个核细胞

在感染、创伤、自身免疫或神经退行性疾病期间，通常需要分离浸润中枢神经系统（CNS）的免疫细胞……

在感染、创伤、自身免疫或神经退行性疾病过程中，免疫细胞会浸润中枢神经系统。尽管组织化学方法可用于确定浸润细胞的位置并分析相关病理变化，但这些技术受限于可同时使用的抗体数量。本文展示了一种快速分离脑和脊髓组织中单个核细胞的方法，其中所分离的组织首先进行匀浆处理。接下来，建立 Percoll 梯度，离心后从界面收集单个核细胞。最后，细胞经洗涤后用抗体染色，通过流式细胞术分析，可区分血液来源的细胞与监视型小胶质细胞，并确定其在疾病状态下的相对比例。该技术相较于现有的 Aris 梯度法或组织化学染色等方法的主要优势在于更节省时间。这使得您能够同时处理更多的组织。梯度设置将由我实验室的技术员 palino A 演示。准备本方案所需的试剂，每只大脑从四毫升储存态等渗 Percoll（称为 SIP）开始。为此，将九份泊油与一份不含钙和镁的10倍浓度HBSS通过倒置混合均匀。接着，在混合制备的SIP与不含钙和镁的1倍浓度HBSS的同时，配制70%的泊油溶液。然后，将2毫升70%的泊油溶液分装至15毫升聚丙烯圆锥管中，用于收集组织。进行此操作时，将所有实验小鼠的离体脑组织和脊髓组织置于含有10毫升RPMI的烧杯中，并置于冰上。随后，将组织转移至7毫升或15毫升的下置式匀浆器中，内含3毫升1倍浓度的HBSS，并先使用松配合的研杵轻轻研磨制成细胞悬液，然后更换为紧密配合的B型研杵，进一步解离组织。组织匀浆后，加入 RPMI 或 1 倍体积的 HBSS，调节终体积至 7 毫升，随后开始制备 Percoll 梯度。首先向细胞悬液中加入 3 毫升 SIP，使 Percoll 的终浓度为 30%。请注意，Percoll 应在室温下使用；若使用低温 Percoll，细胞容易发生聚集，导致细胞分离效率降低。接下来，使用移液器辅助装置的重力模式，将10毫升细胞悬液缓慢地铺加在70% SIP上层。注意避免混合70%和30%的溶液。这是该操作步骤中最关键的一步。在70%至30%交界处应可见一条非常清晰的水平线。通常，初次使用该方法的人会遇到困难，因为在分层过程中第三层和70%的溶液容易混合。下一步，将分层后的混合液在18摄氏度下以500 ×g离心30分钟。确保离心机停止时无或仅有极轻微的刹车，以免扰动界面。离心完成后，管顶应积聚一层浓稠且黏稠的碎片层。其下一层为淡黄色的30% percoll 层，有时含有碎片。接下来是70至30界面，应可见清晰的白色环状层，其中含有单个核细胞。最后，在试管底部为透明的70%Percoll层。若未观察到界面，则细胞收获量可能极低，导致后续分析极为困难。因此，此时可能需要使用新鲜的细胞悬液以减少污染。小心移除试管顶部的碎片层并弃去。然后用塑料移液管穿过每份样本上层的30%部分，收集2至3毫升的70/30界面层，并将其转移至含有8毫升1倍浓度HBSS的洁净锥形管中。将稀释后的界面液轻轻颠倒混匀数次，然后在18摄氏度下以500 ×g离心7分钟。离心后，弃去上清液并重悬沉淀。将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中，加入1毫升细胞染色缓冲液，再洗涤一次。使用微型离心机在4°C、10,000 ×g 条件下离心1分钟，随后进行抗体染色。为阻断Fc结合位点，将细胞沉淀重悬于50 µL纯化的抗小鼠CD16、CD32抗体中，该抗体用细胞染色缓冲液按1:200比例稀释。与任何染色步骤相同，必须对所有抗体进行充分的滴定，并在冰上孵育10分钟。孵育期间，取出2至5 µL细胞，使用血细胞计数板进行细胞计数。合并的 naive 脑和脊髓组织每只小鼠应获得约 3 至 5 × 10⁵ 个细胞。炎症脑组织中的炎性细胞数量会因采集时间点及疾病模型的不同而有所差异。在使用 CD16 和 CD32 孵育后，加入 50 µL 免疫细胞特异性抗体混合液。本示例所用的混合液包含针对 CD45、CD4 和 CD19 的抗体，冰上孵育 30 分钟。重要的是，每种抗体都必须首先进行滴定。为确定最佳稀释度，应根据您所用流式细胞仪的激光器和滤光片配置选择合适的荧光染料组合。细胞染色后，加入一毫升细胞染色缓冲液，以每分钟一转的速度离心一分钟，用细胞染色缓冲液洗涤细胞。离心后在10,000 G下处理，弃去上清液，然后将沉淀重悬于100至200微升细胞染色缓冲液中，用于立即进行流式细胞术分析或后续分析。将细胞重悬于用PBS配制的2%多聚甲醛中，于4摄氏度保存过夜。图中显示的是获得的单个核细胞，经FC阻断剂孵育后，再与抗CD45、CD4和CD19抗体孵育。根据流式细胞术所示的实验方案，CD45染色可将CD45高表达的血液来源细胞与CD45弱表达的监视型小胶质细胞清晰分离。该图比较了从健康小鼠和诱导产生实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）后发生炎症的小鼠脑组织中分离出的细胞。Y轴显示CD45-APC荧光强度，在健康小鼠脑组织中可观察到三个不同的细胞群。仅检测到极少数CD 45高表达细胞，通常少于总分离细胞群体的2%。相比之下，患EAE小鼠的脑组织显示出大量血液细胞浸润并被募集至脑内。添加其他细胞表面标志物（如 CD11b、CD4、CD8 等）可进一步对 CD45 高表达群体进行表征。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三至四小时内完成。在进行该操作时，需牢记组织学方法与流式细胞术免疫表型分析相结合，对于全面表征中枢神经系统（CNS）炎性浸润细胞的组成至关重要。

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