监测免疫细胞在腹腔感染数小时后对荧光标记朊病毒纤维的迁移作用

该实验的主要目的是在感染后数小时内监测免疫细胞对朊病毒的摄取与转运过程。首先，从感染动物的脑组织中纯化并用荧光染料标记聚集态朊病毒纤维，随后将这些标记的朊病毒纤维接种至小鼠腹腔内。接种两小时后，收集腹腔、脾脏以及纵隔和肠系膜淋巴结中的细胞。最后，利用免疫表型标记物对回收的细胞进行染色，并检测其对朊病毒（Prion）的滞留情况。 关键词：朊病毒摄取，免疫细胞，腹腔注射，细胞追踪，荧光标记，Prion滞留，小鼠模型

例如，流式细胞术结果可用于证明朊病毒纤维主要由巨噬细胞和树突状细胞保留和转运，其次为单核细胞，再次为B细胞。该实验系统旨在通过回答一些关键问题，揭示朊病毒的储存库及潜在治疗靶点，例如：感染后哪些细胞立即摄取PrEOn？它们将PrEOn转运至何处？转运速度有多快？

为演示该实验步骤，将由我实验室的研究生 Crystal、Mt.And Brady Michael 操作。为收集 PreOn 蛋白，取 100 毫克 PreOn 感染的脑组织，在 900 毫升预冷的匀浆缓冲液中，使用商用匀浆器于最大转速下匀浆 1 分钟，立即置于冰上孵育 2 分钟。重复此过程三次，以提高蛋白得率。

将匀浆在 3000 ×g、4 °C 条件下离心 10 分钟。移去上清液并置于冰上保存。将沉淀物重悬于 1 升 hp 中，重复匀浆和离心步骤。

现在，合并上清液并在4°C、100,000 ×g条件下离心60分钟。弃去上清液。将沉淀物重悬于100毫升TBST中。

通过 Bradford 法测定蛋白浓度，并用 TBST 将体积调整至每毫升含五毫克蛋白。冰上预冷 30 分钟。再次在 0 摄氏度、100,000 ×g 条件下离心 30 分钟。

弃去SNA，先用50毫升TBST洗涤沉淀。然后用100毫升TBS重悬沉淀，再加入100毫升含1% sarcosyl和蛋白酶抑制剂混合物的1×PBS，于37摄氏度搅拌120分钟。进行蔗糖梯度离心时，将样品铺加到900毫升320毫摩尔蔗糖溶液上，离心60分钟。

在 100,000 × g、10 摄氏度条件下离心。弃去上清液，将沉淀重悬于 10 毫升 2.3 摩尔氯化钠、5% Sarco seal 溶液中。随后以 70% 最大功率超声处理样品，每次 40 秒，共 5 次，每次间隔 1 分钟。

取一毫升样品加入离心管中，于4°C、13,000 ×g条件下离心15分钟。用TBS缓冲液将沉淀洗涤两次，并将样品储存在-70°C。根据生产商说明书，使用一管DITE 649荧光染料对一管纯化的PreOn杆状病毒进行偶联。

最后，通过滤柱离心法将双硫代标记缓冲液更换为PBS。避光保存于-70摄氏度，分装为20微升每份，直至使用前。本部分包括腹腔内接种朊病毒、从腹膜、纵隔、肠系膜淋巴结及脾脏中回收细胞，以及在使用D环荧光朊病毒前的相应操作。

用拇指和食指夹住PBS中1至50号小鼠背部颈后部的皮毛。轻轻将小鼠转向面向你，并用小指固定其尾巴。使小鼠呈仰卧位，将后躯抬高至头部上方，使其略微倒置。

使用30号胰岛素注射器，在距正中线1厘米、距髂前上棘1至2厘米处，皮下注射100微升荧光标记的pion杆。进针深度为皮肤下1厘米，针头方向向内侧倾斜45度。对于对照小鼠，使用1:50稀释的荧光微球或单独使用PBS。根据实验设计，将小鼠孵育指定时间后，开始进行分析。

根据批准的动物护理和使用委员会规程处死小鼠。使用12毫升注射器和25号针头，向腹腔内注射10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。轻轻纵向摇动小鼠一分钟，随后继续进行小鼠解剖。

用70%乙醇彻底润湿小鼠腹部的毛发。用镊子提起肋骨下方中线处的皮肤，用剪刀在皮肤上剪开一个小切口。然后分别向头部和尾部方向沿皮肤切开3至5厘米的切口。

从身体两端中线向外侧做2厘米长的切口，剥开皮肤并用针固定，以暴露腹腔和胸腔。使用同一注射器和16号针头回收腹膜中的细胞悬液。将渗出液置于15毫升锥形管中，并置于冰上保存。

小心切开包裹腹膜的薄而半透明的膜，并将胸腔掀开以暴露纵隔。现在寻找并摘除2至4个纵隔淋巴结，这些淋巴结位于胸腺稍偏背侧和外侧、头臂动脉内侧，靠近气管腹面。接着，寻找并摘除最多6个肠系膜淋巴结，这些淋巴结嵌在柔软的白色肠系膜组织中，该组织将肠道固定于腹后壁。

将淋巴结保存在1 mL冰上预冷的PMI 1640培养基中，直至切片完成。最后，找到并取出脾脏。脾脏是一个长条状、暗红色的器官，位于小鼠左侧体腔中线外侧、肠道背侧。

使用1毫升注射器的推杆，在塑料培养皿中将淋巴结通过40微米细胞筛研磨并压入3毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。用额外的2毫升PBS冲洗细胞筛，并将总共5毫升的细胞悬液转移至15毫升锥形管中。同时，用额外的5毫升PBS冲洗培养皿，并将其一并转移至同一根试管中。

将样品在250 ×g下离心5分钟。弃去上清液，重悬细胞沉淀。用1毫升fax缓冲液将分离的细胞转移至1.5毫升EOR管中。

通常，该染色方案可用于鉴定免疫细胞亚群，使用针对特征明确的免疫细胞表面标志物的荧光抗体，并将所有抗体加入 fax 缓冲液中。使用前立即进行操作。计数细胞，并将 10 的 6 次方个细胞分装至 einor 管中，通过离心收集细胞沉淀，再用一毫升 fax 缓冲液洗涤沉淀两次，以阻断内源性 FC 受体。

将细胞与100微升含2纳克/毫升大鼠抗-US CD 1632的溶液在冰上孵育20分钟，离心收集细胞后用fax缓冲液洗涤细胞。随后，向每个样本中加入100微升含1纳克/毫升适当荧光标记抗体或多种抗体的溶液，在冰上孵育1小时。对照细胞仅加入100微升fax缓冲液，离心并用fax缓冲液洗涤细胞两次。

将细胞重悬于1 mL act缓冲液中，冰上孵育1分钟。为裂解红细胞沉淀并洗涤细胞，用fax缓冲液重悬细胞，再加入1 mL fax缓冲液。使用流式细胞仪分析样品，通常配备405 nm、488 nm和633 nm激发激光器，以及5至10个荧光发射检测器。

粗制朊病毒，即感染性脑组织匀浆，含有大量朊病毒。纯化过程包括使用去垢剂处理、溶解以及对两份麋鹿脑组织匀浆进行超速离心。最终产物为蛋白酶抗性蛋白。

对特定细胞群进行的K抗性传真分析表明，抗原呈递细胞在2小时内归巢至腹膜，并保留荧光微珠和朊病毒纤维。来自微珠和朊病毒接种小鼠的细胞显示出显著的荧光信号，尤其在单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞上更为明显。

在纵隔淋巴结中也发现了携带PreOn的单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞。接种后2小时，我们在肠系膜淋巴结中未检测到微珠或PreOn杆状物。本实验中，视频展示了若干项实验方案：从感染脑组织中纯化聚集的朊病毒杆状物，进行腹腔注射，正确识别并分离淋巴结，以及最终分离和染色免疫细胞。