Name: 监测后腹腔感染的免疫细胞贩运荧光朊病毒棒时间 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 了解朊病毒被免疫细胞摄取和转运的新型检测方法。通过荧光标记朊病毒棒并接种小鼠，利用流式细胞术分析巨噬细胞和树突状细胞对朊病毒的保留情况，为研究朊病毒生物学和免疫相互作用提供重要工具。

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感谢 Steve McBryant 和 Jeff Hansen 在超速离心方面的帮助，以及 Patti Kiser 在小鼠操作方面的协助。本研究由美国国立卫生研究院下属的国家神经疾病与卒中研究所资助，项目编号为 5R01NS056379-02。

1. 朊病毒纤维的纯化与标记
本方案改编自先前已发表的一项研究18
<ol>
<li>将100克朊病毒感染的脑组织在900 mL冰浴匀浆缓冲液（HB，含320 mM蔗糖、150 mM NaCl和4 mM EDTA的1×PBS）中，使用商用匀浆器以最大速度匀浆1分钟，然后在冰上静置2分钟。重复此步骤三次。</li>
<li>将匀浆液在3000 × g、4°C条件下离心10分钟。移去上清液并置于冰上保存。将沉淀物重悬于1 L HB中，并重复步骤1.1和1.2。</li>
<li>合并所有上清液，在100,000 × g、0°C条件下离心60分钟。弃去上清液。</li>
<li>将沉淀物重悬于100 mL含2% Triton X-100的1×Tris缓冲盐水（TBST，10 mM Tris-HCl、0.1 mM NaCl和1 mM EDTA）中。通过Bradford法或类似方法测定蛋白浓度，并用TBST调节至5 mg/mL。在冰上冷却30分钟。</li>
<li>在100,000 × g、0°C条件下离心30分钟。弃去上清液，依次用50 mL TBST和100 mL TBS洗涤沉淀物。将沉淀物重悬于100 mL含1% Sarkosyl和蛋白酶抑制剂混合物的1×PBS中，在37°C下搅拌120分钟。</li>
<li>将样品铺在900 mL 320 mM蔗糖溶液上，在100,000 × g、10°C条件下离心60分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于10 mL含2.3 M NaCl和5% Sarkosyl的溶液中。</li>
<li>在冰上以最大功率的70%进行超声处理，每次40秒，共5次，每次间隔1分钟。</li>
<li>将1 mL样品分装至微量离心管中，在13,000 × g、4°C条件下离心15分钟。用TBS洗涤沉淀物两次，储存于-70°C，或按步骤1.9进行荧光染料偶联。</li>
<li>使用1瓶DyLight 649荧光染料，按照生产商提供的方案对1管纯化的朊病毒纤维进行偶联标记。</li>
<li>通过透析或滤柱离心将DyLight标记缓冲液置换为PBS。分装为20 μL每份，避光保存于-70°C，待用时取出。</li>
</ol>
2. 朊病毒接种与细胞回收
本部分包括腹腔内接种朊病毒以及从腹膜、纵隔和肠系膜淋巴结及脾脏中回收细胞。
<ol>
<li>使用前立即用 PBS 将荧光朊病毒纤维稀释 1:50。用拇指和食指抓住小鼠背部颈部的皮肤，轻轻将小鼠翻转使其面向操作者，并用小指固定尾巴。使小鼠呈仰卧位，将后躯抬高过头部，略微倒置固定。</li>
<li>使用 30G 胰岛素注射器，在距中线外侧 1 cm、距骶髂关节前 1–2 cm 处皮下注射 100 μL 荧光朊病毒纤维。将针头以 45° 向内倾斜插入皮肤下 1 cm。以 1:50 稀释的荧光微珠或单独 PBS 作为对照。在分析前，按照规定时间孵育小鼠。</li>
<li>根据批准的动物护理与使用委员会规程实施小鼠安乐死。使用 12 mL 注射器和 25G 针头向腹腔内注射 10 mL PBS。沿身体长轴轻轻摇动尸体 1 分钟。用同一注射器配合 16G 针头从腹腔回收细胞悬液至 15 mL 锥形管中，置于冰上暂存，同时继续进行尸体解剖。</li>
<li>用 70% 乙醇充分润湿尸体腹侧。用镊子在肋弓下方中线处提起皮肤，用剪刀剪开一小切口。从此处开始，沿中线向头侧和尾侧分别剪开 3–5 cm 长的切口，再从两端各向两侧剪开两条 2 cm 的横向切口。将皮肤向两侧剥离并用针固定，暴露腹腔和胸腔。小心剪开包围腹腔的薄而透明的膜，并掀开胸腔以暴露纵隔。</li>
<li>寻找并取出 2–4 个位于胸腺背外侧、头臂动脉内侧、靠近气管腹侧的纵隔淋巴结。寻找并取出最多六个埋藏于柔软白色肠系膜组织中的肠系膜淋巴结，该组织将肠道锚定于腹后壁。寻找并取出脾脏，脾脏为一长条状、深红色器官，位于腹部左侧、中线外侧、肠道背侧。将取出的淋巴结置于冰上含 1 mL RPMI 1640 培养基的容器中，直至解剖完成。</li>
<li>在塑料培养皿中，使用 1 mL 注射器的推杆将淋巴结碾碎并通过 40 μm 细胞筛滤入 3 mL RPMI 培养基中。用额外 2 mL RPMI 冲洗滤网，并将滤出液转移至 5 mL 细胞悬液中，合并至 15 mL 锥形管。用额外 5 mL RPMI 冲洗培养皿，并将冲洗液也转移至同一锥形管。250 × g 离心 5 分钟，弃上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液（1× PBS、1% 牛血清白蛋白和 10 mM EDTA）中，转移至 1.5 mL Eppendorf 管。</li>
</ol>
3. 细胞染色与流式细胞术
以下是一种使用针对特征明确的免疫细胞表面标志物的荧光抗体来鉴定免疫细胞亚群的典型染色方案。所有抗体均在使用前立即用FACS缓冲液稀释。
<ol>
<li>计数细胞，并将106个细胞分装至离心管中。离心细胞（参见2.7），用1 mL FACS缓冲液重悬细胞沉淀，洗涤两次。</li>
<li>在冰上用100 μL含2 ng/mL大鼠抗小鼠CD16/32的溶液孵育细胞20分钟，以阻断内源性Fc受体。离心后用FACS缓冲液洗涤细胞。</li>
<li>向各样品中加入100 μL含1 ng/mL相应荧光标记抗体的溶液，在冰上孵育1小时。向对照细胞中仅加入100 μL FACS缓冲液。用FACS缓冲液洗涤细胞两次。</li>
<li>将细胞重悬于1 mL ACK裂解缓冲液（150 mM NH4Cl，1 mM KHCO3和0.1 mM EDTA）中，在冰上孵育1分钟以裂解红细胞。离心后用FACS缓冲液洗涤细胞，再用1 mL FACS缓冲液重悬细胞。</li>
<li>使用具备多色检测与分析能力的流式细胞仪采集细胞数据，通常配备405、488和633 nm激发激光器，以及五至十个荧光发射检测通道。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
我们从粗制的、感染朊病毒的脑匀浆中纯化出朊病毒杆状结构（图1）。对E2型麋鹿脑匀浆进行去垢剂溶解和超速离心（泳道1和2）可显著富集朊病毒杆状结构（比较泳道1和3），且该结构对蛋白酶K具有抗性（泳道4）。有趣的是，未消化的纯化朊病毒杆状结构表现出的糖型谱与经消化的E2脑匀浆极为相似，表明朊病毒得到了显著富集。经相同处理的正常脑匀浆则未产生任何蛋白酶K抗性的PrPC（泳道5和6）。
对特定细胞群的流式细胞术分析表明，抗原呈递细胞在注射后两小时内即归巢至腹膜腔，并摄取荧光微球和朊病毒纤维，其荧光强度显著高于PBS注射对照组（图2）。PBS处理的对照组小鼠腹膜腔中分离的细胞均未显示高于背景水平的荧光信号（图2A-G），而注射微球（图2H-N）和朊病毒（图2O-U）的小鼠中，其细胞显示出明显荧光，尤其在单核细胞（图2I 和 P）、树突状细胞（图2K 和 R）和巨噬细胞（图2L 和 S）上，部分中性粒细胞（图2J 和 Q）以及较少的B细胞（图2T）也呈阳性。在接种后两小时，携带微球和朊病毒的单核细胞、树突状细胞及巨噬细胞亦可在纵隔淋巴结中检测到（分别为 图2AD 与 AK、AF 与 AM 以及 AG 与 AN），而在该部位几乎未检测到携带PrPCWD的中性粒细胞、B细胞或T细胞（分别为 图2AE 与 AL、AH 与 AG 以及 AI 与 AP）。我们在脾脏或肠系膜淋巴结中未检测到微球或朊病毒纤维（数据未显示）。综上，这些结果表明，免疫细胞对朊病毒的转运方式与其他颗粒性抗原极为相似。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>试剂</td>
 <td>荧光染料</td>
 <td>激发激光 (nm)</td>
 <td>峰值发射 (nm)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>朊病毒纤维</td>
 <td>DyLight 649</td>
 <td>633</td>
 <td>674</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 μm 微球</td>
 <td>AlexaFluor 660</td>
 <td>633</td>
 <td>685</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>抗体</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CD11b</td>
 <td>eFluor 450</td>
 <td>405</td>
 <td>450</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>Phycoerythrin-Cy7</td>
 <td>488</td>
 <td>760</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CD11c</td>
 <td>R-Phycoerythrin</td>
 <td>488</td>
 <td>575</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>Phycoerythrin-Cy7</td>
 <td>488</td>
 <td>760</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ly6C</td>
 <td>Fluoroisothiocyante</td>
 <td>488</td>
 <td>518</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ly6G</td>
 <td>R-Phycoerythrin</td>
 <td>488</td>
 <td>575</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CD21</td>
 <td>DyLight 488</td>
 <td>488</td>
 <td>518</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B220</td>
 <td>Allophycocyanin-Cy7</td>
 <td>633</td>
 <td>785</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CD3</td>
 <td>R-Phycoerythrin</td>
 <td>488</td>
 <td>575</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表1. 荧光试剂的光谱特性
 <img src="/files/ftp_upload/2349/2349fig1.jpg" alt="Western blot分析；蛋白质条带；E2 BH，纯化的E2杆状物，正常BH；蛋白酶处理。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 从感染性脑匀浆中纯化朊病毒杆状物。 我们以来自慢性消耗性疾病（CWD）感染鹿的10%粗制脑匀浆（E2，泳道1和2）为起始材料，从中纯化出聚集态的朊病毒杆状物（泳道3和4）。粗制和纯化的样品均表现出对蛋白酶K处理的特征性抗性（泳道1–4），而正常脑匀浆则无此抗性（泳道5和6）。分子量标记以kD显示在印迹左侧。BH，脑匀浆。
 <img src="/files/ftp_upload/2349/2349fig2.jpg" alt="流式细胞术分析示意图；免疫细胞中荧光微球/朊病毒结合；散点图结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 接种后两小时，从小鼠腹腔向纵隔淋巴结转运朊病毒的免疫细胞的流式细胞术分析。 将 PBS（图 A-G 和 V-AB）、荧光微球（图 H-N 和 AC-AI）或朊病毒纤维（图 O-U 和 AJ-AP）注射至小鼠腹腔，两小时后从小鼠腹腔灌洗液（A-U）或纵隔淋巴结（V-AP）中收集细胞。第一列图显示 PBS 处理小鼠（图 A 和 V）、荧光微球处理小鼠（图 H 和 AC）及朊病毒纤维处理小鼠（图 O 和 AJ）的细胞。荧光细胞（红色或绿色点）和总细胞（灰色点）在图中按相对大小（前向散射）、颗粒度（侧向散射）以及活细胞中荧光细胞所占比例进行绘制。大量具有粒细胞特征的细胞保留了荧光微球和纤维。细胞还使用针对免疫细胞表面标志物的抗体进行染色，并设门区分 Ly6G- Ly6C+ 单核细胞（图 B、I、P、W、AD 和 AK）、Ly6C- CD11c- CD11b+ Ly6G+ 中性粒细胞（图 C、J、Q、X、AE 和 AL）、Ly6G- Ly6C- CD11b+ CD11c+ 树突状细胞（图 D、K、R、Y、AF 和 AM）、Ly6G- Ly6C- CD11c- CD11b+ 巨噬细胞（图 E、L、S、Z、AG 和 AN）、CD3- B220+ CD21+ B 细胞（图 F、M、T、AA、AH 和 AO）以及 CD21- B220- CD3+ T 细胞（图 G、N、U、AB、AI 和 AP）。单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞在腹腔内保留了荧光微球和朊病毒纤维（分别为图 I 和 P、K 和 R、L 和 S），并将其转运至纵隔淋巴结（分别为图 AD 和 AK、AF 和 AM、AG 和 AN），表明这两种颗粒物具有相似的摄取和转运行为。中性粒细胞保留了大量微球（图 J）和较少纤维（图 Q），但未能将其递送至淋巴结（图 AE 和 AL）。B 细胞保留并转运了一些纤维（图 T 和 AO），但几乎不保留微球（图 M 和 AH）。T 细胞既未转运微球也未转运纤维（图 N、U、AI 和 AP）。

<ol><li>Klein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crucial+role+for+B+cells+in+neuroinvasive+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie.</a> Nature. 390, 687-687 (1997).</li>
<li>Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+immune+system+in+TSE+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Involvement of the immune system in TSE pathogenesis.</a> Immunol Today. 19, 201-201 (1998).</li>
<li>Sigurdson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PrP%28CWD%29+lymphoid+cell+targets+in+early+and+advanced+chronic+wasting+disease+of+mule+deer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer.</a> J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).</li>
<li>Klein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+facilitates+early+prion+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Complement facilitates early prion pathogenesis.</a> Nat Med. 7, 488-488 (2001).</li>
<li>Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+depletion+of+complement+component+C3+or+genetic+deficiency+of+C1q+significantly+delays+onset+of+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie.</a> Nat Med. 7, 485-485 (2001).</li>
<li>Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Complement+Receptor+CD21%2F35+Facilitates+Lymphoid+Prion+Colonization+and+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis.</a> J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).</li>
<li>Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+depletion+of+CD11c%2B+dendritic+cells+delays+lymphoinvasion+after+intraperitonal+scrapie+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection.</a> J Virol. 82, 8933-8933 (2008).</li>
<li>Dorban, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+scrapie+infection+modifies+the+homeostasis+of+Peyer%27s+patches%27+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer's patches' dendritic cells.</a> Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).</li>
<li>Flores-Langarica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie+pathogenesis%3A+the+role+of+complement+C1q+in+scrapie+agent+uptake+by+conventional+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).</li>
<li>Huang, F. P., MacPherson, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+oral+transmission+of+prion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and oral transmission of prion diseases.</a> Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).</li>
<li>Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+dynamics+of+infectious+prion+protein+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept+Lett%22%5BJournal%5D)">Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine.</a> Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).</li>
<li>Aucouturier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infected+splenic+dendritic+cells+are+sufficient+for+prion+transmission+to+the+CNS+in+mouse+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie.</a> J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).</li>
<li>Huang, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+intestinal+dendritic+cells+transport+PrP%28Sc%29+from+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut.</a> J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).</li>
<li>Jeffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transportation+of+prion+protein+across+the+intestinal+mucosa+of+scrapiesusceptible+and+scrapie-resistant+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep.</a> J Pathol. 209, 4-4 (2006).</li>
<li>Raymond, C. R., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+involvement+of+migratory+dendritic+cells+in+the+transfer+of+the+scrapie+agent+from+the+immune+to+peripheral+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems.</a> J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).</li>
<li>Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-derived+dendritic+cells+acquire+and+degrade+the+scrapie+agent+following+in+vitro+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure.</a> Immunology. 116, 122-122 (2005).</li>
<li>Gilch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+and+LPS+can+interfere+negatively+with+prion+clearance+in+macrophage+and+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells.</a> FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).</li>
<li>Safar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mass%2C+biochemical+composition%2C+and+physicochemical+behavior+of+the+infectious+form+of+the+scrapie+precursor+protein+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).</li>
<li>Büeler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+devoid+of+PrP+are+resistant+to+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mice devoid of PrP are resistant to scrapie.</a> Cell. 73, 1339-1339 (1993).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

此处我们展示了一种用于标记和追踪朊病毒的实验方案 体内 这极大地促进了对外周朊病毒早期感染事件的监测。该方案显著改进了以往对朊病毒摄取监测的尝试。 体外 9 和 体内 3,12 通过预先标记高度富集的朊病毒接种物，以明确区分其与内源性PrPC. 由于具有感染性的朊病毒和PrPC 共享相同的初级氨基酸序列，因此制备针对朊病毒的特异性抗体一直存在困难。我们曾使用蛋白酶K消化并经甲醇沉淀的粗制脑组织匀浆，注射至PrP基因敲除小鼠体内，并用Dylight 649标记的抗-PrP抗体进行追踪（未发表数据）。这些实验获得的结果与本研究展示的结果几乎一致，但PrP基因敲除小鼠无法商业获取，且对朊病毒疾病不具易感性 19 且缺乏目前已知的唯一真正的朊病毒受体PrPC该方案允许使用表达内源性PrP的常见实验小鼠品系C，避免了使用PrP基因敲除小鼠可能带来的问题。
此处显示的数据表明，免疫细胞对...

<table><tbody><tr><td>慢性消耗性疾病感染的麋鹿脑</td><td>科罗拉多州私人麋鹿养殖场</td><td></td><td>使用任何非人类朊病毒感染名脑组织</td></tr><tr><td>搅拌器</td><td>Oster 专业产品</td><td>6694-015</td><td>使用任何市售搅拌机</td></tr><tr><td>离心</td><td>Sorvall，赛默飞世尔科技</td><td>SS34 转子</td><td>使用任何可达到 3000 x g 且能容纳 &amp;#8805; 500 ml 体积</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>50.2 Ti 转子</td><td>使用任何可达到 100,000 x g 并能容纳 &amp;#8805; 500 ml 体积</td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>完全迷你蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏集团</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Misonix</td><td>MP4000X</td><td>使用任何设定为最大功率约70%的探头超声仪或喇叭超声仪</td></tr><tr><td>DyLight 抗体标记试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>53050</td><td></td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>55430R</td><td>使用任何可达到13,000x的制冷微量离心机 &lt;em&gt;g&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>离心过滤柱</td><td>EMD Millipore</td><td>Microcon YM-100</td><td>使用截留分子量为100 Kd的滤膜或透析膜</td></tr><tr><td>8-40周龄的FVB小鼠</td><td>查尔斯河实验室</td><td>207</td><td>使用任何近交系小鼠品系</td></tr><tr><td>1 &amp;mu;m 红色荧光微球</td><td>Phosphorex</td><td>2307</td><td>使用任意荧光微球 &amp;#8804; 10 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基 </td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m细胞滤器</td><td>Falcon BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>荧光抗体</td><td>BD生物科学</td><td>各种</td><td>使用适合您实验应用的任何荧光抗体。</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Dako</td><td>CyanADP</td><td>使用任何能够进行多色荧光检测的流式细胞仪</td></tr></tbody></table>

监测免疫细胞在腹腔感染数小时后对荧光标记朊病毒纤维的迁移作用

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

存在一种异常构象的宿主编码型朊蛋白（PrPC），其具有抗蛋白酶特性，并表现出病理性和传染性，这是朊蛋白病的特征，例如鹿科动物的慢性消耗性疾病（CWD）和羊的瘙痒病。朊病毒假说认为，这种异常构象体构成了传染性朊病毒的大部分或全部成分。免疫系统在CWD和瘙痒病外周朊病毒致病早期事件中的作用已得到充分证实 1-3转基因和药理学小鼠研究表明，补体系统在感染早期维持和复制朊病毒方面具有重要作用 4-6. 体外 和 体内 研究还观察到树突状细胞对朊病毒的滞留作用 7-10，尽管它们在运输中的作用尚不明确 11-16巨噬细胞同样被认为参与了朊病毒病的早期发病机制，但这些研究主要关注感染后数周内发生的时间过程 3,11,17这些先前的研究还存在难以区分内源性PrP的问题C 以及具有感染性的朊病毒。本文描述了一种半定量且无偏倚的方法，用于评估募集至接种部位的免疫细胞对朊病毒的摄取及其转运过程。聚集态的朊病毒棒状结构通过去垢剂溶解感染脑组织匀浆中的非聚集蛋白，并经蔗糖垫超速离心进行纯化。聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯亮蓝染色及蛋白质印迹分析证实，沉淀组分中富含高度纯化的朊病毒棒状结构。将荧光染料标记的朊病毒棒状结构经腹腔注射入小鼠体内，2小时后收集腹腔灌洗液、脾脏以及纵隔和肠系膜淋巴结中的免疫细胞，利用针对单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞以及B细胞和T细胞的多色流式细胞术标记物，检测各细胞亚群对朊病毒棒状结构的滞留情况。该检测方法首次实现了对获取并转运朊病毒的免疫细胞进行直接监测。 体内 感染后数小时内即可检测。该检测方法还能明确区分具有感染性的聚集态朙蛋白与宿主细胞正常表达的PrPC，而在其他检测系统中，二者的区分往往较为困难，易导致数据解读问题。本方案还可适用于其他接种途径（如口服、静脉注射、神经内注射和皮下注射）以及多种抗原（如偶联微珠、细菌、病毒和寄生虫病原体及蛋白质、卵蛋白等）。

本文介绍了一种新方法，用于监测免疫细胞在腹腔接种后立即摄取和转运朊病毒的过程。该方法通过纯化来自感染脑组织的聚集性朊病毒纤维，并用荧光标记，随后追踪其从注射部位的摄取与移动情况，并鉴定介导这些过程的细胞类型。

存在一种宿主编码的朊蛋白（PrPC）的异常形式，该形式具有抗蛋白酶特性，并表现出病理性和传染性，这是朊病毒病的特征，例如……

该实验的主要目的是在感染后数小时内监测免疫细胞对朊病毒的摄取与转运过程。首先，从感染动物的脑组织中纯化并用荧光染料标记聚集态朊病毒纤维，随后将这些标记的朊病毒纤维接种至小鼠腹腔内。接种两小时后，收集腹腔、脾脏以及纵隔和肠系膜淋巴结中的细胞。最后，利用免疫表型标记物对回收的细胞进行染色，并检测其对朊病毒（Prion）的滞留情况。

关键词：朊病毒摄取，免疫细胞，腹腔注射，细胞追踪，荧光标记，Prion滞留，小鼠模型例如，流式细胞术结果可用于证明朊病毒纤维主要由巨噬细胞和树突状细胞保留和转运，其次为单核细胞，再次为B细胞。该实验系统旨在通过回答一些关键问题，揭示朊病毒的储存库及潜在治疗靶点，例如：感染后哪些细胞立即摄取PrEOn？它们将PrEOn转运至何处？转运速度有多快？为演示该实验步骤，将由我实验室的研究生 Crystal、Mt.And Brady Michael 操作。为收集 PreOn 蛋白，取 100 毫克 PreOn 感染的脑组织，在 900 毫升预冷的匀浆缓冲液中，使用商用匀浆器于最大转速下匀浆 1 分钟，立即置于冰上孵育 2 分钟。重复此过程三次，以提高蛋白得率。将匀浆在 3000 ×g、4 °C 条件下离心 10 分钟。移去上清液并置于冰上保存。将沉淀物重悬于 1 升 hp 中，重复匀浆和离心步骤。现在，合并上清液并在4°C、100,000 ×g条件下离心60分钟。弃去上清液。将沉淀物重悬于100毫升TBST中。通过 Bradford 法测定蛋白浓度，并用 TBST 将体积调整至每毫升含五毫克蛋白。冰上预冷 30 分钟。再次在 0 摄氏度、100,000 ×g 条件下离心 30 分钟。弃去SNA，先用50毫升TBST洗涤沉淀。然后用100毫升TBS重悬沉淀，再加入100毫升含1% sarcosyl和蛋白酶抑制剂混合物的1×PBS，于37摄氏度搅拌120分钟。进行蔗糖梯度离心时，将样品铺加到900毫升320毫摩尔蔗糖溶液上，离心60分钟。在 100,000 × g、10 摄氏度条件下离心。弃去上清液，将沉淀重悬于 10 毫升 2.3 摩尔氯化钠、5% Sarco seal 溶液中。随后以 70% 最大功率超声处理样品，每次 40 秒，共 5 次，每次间隔 1 分钟。取一毫升样品加入离心管中，于4°C、13,000 ×g条件下离心15分钟。用TBS缓冲液将沉淀洗涤两次，并将样品储存在-70°C。根据生产商说明书，使用一管DITE 649荧光染料对一管纯化的PreOn杆状病毒进行偶联。最后，通过滤柱离心法将双硫代标记缓冲液更换为PBS。避光保存于-70摄氏度，分装为20微升每份，直至使用前。本部分包括腹腔内接种朊病毒、从腹膜、纵隔、肠系膜淋巴结及脾脏中回收细胞，以及在使用D环荧光朊病毒前的相应操作。用拇指和食指夹住PBS中1至50号小鼠背部颈后部的皮毛。轻轻将小鼠转向面向你，并用小指固定其尾巴。使小鼠呈仰卧位，将后躯抬高至头部上方，使其略微倒置。使用30号胰岛素注射器，在距正中线1厘米、距髂前上棘1至2厘米处，皮下注射100微升荧光标记的pion杆。进针深度为皮肤下1厘米，针头方向向内侧倾斜45度。对于对照小鼠，使用1:50稀释的荧光微球或单独使用PBS。根据实验设计，将小鼠孵育指定时间后，开始进行分析。根据批准的动物护理和使用委员会规程处死小鼠。使用12毫升注射器和25号针头，向腹腔内注射10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。轻轻纵向摇动小鼠一分钟，随后继续进行小鼠解剖。用70%乙醇彻底润湿小鼠腹部的毛发。用镊子提起肋骨下方中线处的皮肤，用剪刀在皮肤上剪开一个小切口。然后分别向头部和尾部方向沿皮肤切开3至5厘米的切口。从身体两端中线向外侧做2厘米长的切口，剥开皮肤并用针固定，以暴露腹腔和胸腔。使用同一注射器和16号针头回收腹膜中的细胞悬液。将渗出液置于15毫升锥形管中，并置于冰上保存。小心切开包裹腹膜的薄而半透明的膜，并将胸腔掀开以暴露纵隔。现在寻找并摘除2至4个纵隔淋巴结，这些淋巴结位于胸腺稍偏背侧和外侧、头臂动脉内侧，靠近气管腹面。接着，寻找并摘除最多6个肠系膜淋巴结，这些淋巴结嵌在柔软的白色肠系膜组织中，该组织将肠道固定于腹后壁。将淋巴结保存在1 mL冰上预冷的PMI 1640培养基中，直至切片完成。最后，找到并取出脾脏。脾脏是一个长条状、暗红色的器官，位于小鼠左侧体腔中线外侧、肠道背侧。使用1毫升注射器的推杆，在塑料培养皿中将淋巴结通过40微米细胞筛研磨并压入3毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。用额外的2毫升PBS冲洗细胞筛，并将总共5毫升的细胞悬液转移至15毫升锥形管中。同时，用额外的5毫升PBS冲洗培养皿，并将其一并转移至同一根试管中。将样品在250 ×g下离心5分钟。弃去上清液，重悬细胞沉淀。用1毫升fax缓冲液将分离的细胞转移至1.5毫升EOR管中。通常，该染色方案可用于鉴定免疫细胞亚群，使用针对特征明确的免疫细胞表面标志物的荧光抗体，并将所有抗体加入 fax 缓冲液中。使用前立即进行操作。计数细胞，并将 10 的 6 次方个细胞分装至 einor 管中，通过离心收集细胞沉淀，再用一毫升 fax 缓冲液洗涤沉淀两次，以阻断内源性 FC 受体。将细胞与100微升含2纳克/毫升大鼠抗-US CD 1632的溶液在冰上孵育20分钟，离心收集细胞后用fax缓冲液洗涤细胞。随后，向每个样本中加入100微升含1纳克/毫升适当荧光标记抗体或多种抗体的溶液，在冰上孵育1小时。对照细胞仅加入100微升fax缓冲液，离心并用fax缓冲液洗涤细胞两次。将细胞重悬于1 mL act缓冲液中，冰上孵育1分钟。为裂解红细胞沉淀并洗涤细胞，用fax缓冲液重悬细胞，再加入1 mL fax缓冲液。使用流式细胞仪分析样品，通常配备405 nm、488 nm和633 nm激发激光器，以及5至10个荧光发射检测器。粗制朊病毒，即感染性脑组织匀浆，含有大量朊病毒。纯化过程包括使用去垢剂处理、溶解以及对两份麋鹿脑组织匀浆进行超速离心。最终产物为蛋白酶抗性蛋白。对特定细胞群进行的K抗性传真分析表明，抗原呈递细胞在2小时内归巢至腹膜，并保留荧光微珠和朊病毒纤维。来自微珠和朊病毒接种小鼠的细胞显示出显著的荧光信号，尤其在单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞上更为明显。在纵隔淋巴结中也发现了携带PreOn的单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞。接种后2小时，我们在肠系膜淋巴结中未检测到微珠或PreOn杆状物。本实验中，视频展示了若干项实验方案：从感染脑组织中纯化聚集的朊病毒杆状物，进行腹腔注射，正确识别并分离淋巴结，以及最终分离和染色免疫细胞。

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