斑马鱼中运动神经元与靶向骨骼肌的配对膜片钳记录

本实验的总体目标是同时获取运动神经元动作电位及其在靶肌肉中引发的突触反应的电生理记录。首先需去除鱼体背部的皮肤，以暴露目标区域；实验的第二步是通过移除覆盖在脊髓上方的所有背侧肌细胞，从而暴露脊髓。

该操作流程的第三步是通过去除表层的慢肌来暴露目标快肌。最后一步是对毛毛初级神经元或帽状神经元进行电流钳制，并对目标骨骼肌进行电压钳制。最终，可通过同时对运动神经元进行电流钳制和对目标肌肉进行电压钳制，获得显示肌肉中突触反应的结果，这些反应与运动神经元动作电位的发放相关。

LaVar超级鱼提供了一系列优势，便于成对的运动神经元与骨骼肌进行记录；其肌肉体积小，便于实现有效的电压钳制；且其运动神经元具有典型特征，易于识别和接触。接下来，我将逐步介绍建立神经元与肌肉膜片钳记录所需的操作步骤。在开始实验前，需准备五种关键溶液，包括：浴液、含Trica的浴液、含IDE的浴液、神经元内液以及肌肉内液。

接下来，选取一条年龄在72至96小时之间的单个斑马鱼幼鱼，放入含有三卡因（trica）的浴液中。暴露于麻醉剂后一分钟内，鱼将不再有反应。将其放置在塑料培养皿上，使用体视显微镜，用双刃剃须刀片进行断头操作。

将鱼转移至一个已涂有沙丁（sard）并盛满鲈鱼溶液的玻璃记录室中。在鱼体前端附近用一枚针制作一个皮瓣，以便用一对精细镊子牢固夹持。用精细镊子夹住靠近前端针孔处的覆盖皮肤，将其移除。

沿煮制方向缓慢剥去表皮。用含有form IDE的浴液处理鱼体3毫升，处理3至5分钟，以阻断可能干扰记录的肌肉收缩。用正常浴液洗涤5次。

用钨针侧面轻轻刮除五到六个节段的浅层肌肉组织。将鱼转移至位于法拉第笼内的直立式显微镜中，以屏蔽电噪声。该显微镜配备固定载物台、长工作距离的40倍物镜，以及0.5至4倍的变焦功能。

显微镜安装在电动控制的XY平移台上。为了在高倍镜下将标本在神经和肌肉之间移动，使用微分干涉差光学系统可在0.5倍变焦下观察到神经元。使用内径较宽的15微米移液管去除覆盖的肌肉，暴露脊髓。

通过一个3 cc的一次性注射器施加负压，逐个移除肌肉细胞。该操作需在骨骼肌的5至6个背侧节段重复进行。同一支宽口径移液管也用于移除腹侧肌肉的上两层，以获取目标快速骨骼肌。

至此，配对记录的准备工作完成，显微镜放大倍数增加至约 1.6 倍。扫描清洁的节段以定位帽状神经元。每段脊髓 HEMI 节段包含一个直径为 10 微米的大型帽状运动神经元。

这种泪滴状的胞体位于脊髓节段边界最尾端附近的浅层脊髓区域。选择一个帽状神经元进行记录，并扫描其相关的尾段腹侧靶肌肉区域以检查完整性。放置两个膜片电极用于记录，一个用于神经元，另一个用于肌肉。

上部电极具有较浅的锥形尖端，用于穿透坚韧的脊髓硬膜，其尖端开口约为两微米。下部电极具有更陡的锥形，适用于骨骼肌的低电阻电压钳记录。将神经元电极以约30度的角度放置，以穿透脊髓硬膜。

在选定的帽状神经元前方约半个节段处，使用轴向驱动操纵器推进电极，同时施加约60毫米汞柱的轻柔持续正压。当电极穿过硬脑膜时，电极灌注液可能导致帽状神经元移位，需要重新调整焦距。当电极接触帽状神经元胞体时，释放正压，通常会立即形成吉欧封接（giga seal）。

然而，在某些情况下，若封接未能形成，则需要施加轻微的负压。封接形成后，将电极电位调节至负80毫伏，施加负压可使细胞膜破裂。帽状神经元的特征是输入电阻为140至180兆欧，动作电位可超过正40毫伏。

通过在电流钳制下逐步增加去极化刺激，直至引发动作电位，来检测该指标。随后，使用XY轴电动位移器将显微镜移动至腹侧肌肉。在高倍镜下，从目标视野中选择一个快肌细胞。

在正压作用下，将肌细胞电极推进至目标肌细胞，撤去正压后形成吉欧封接，将电极电位调节至负50毫伏以失活钠通道。随后施加轻柔负压，使细胞膜破裂。电阻下降至100至200兆欧，并突然出现较大的电容性瞬变信号，表明已进入细胞，可进行配对测试。

通过逐步增加电流注入使运动神经元去极化，直至引发动作电位。此时，应能在肌肉中诱发出终板电流；以1 Hz频率持续刺激运动神经元，可产生无衰减的终板电流。当刺激频率升高至100 Hz时，终板电流的幅度出现波动，并在刺激开始后10秒内发生功能性耗竭。

通常，神经元记录可稳定维持长达一小时，但肌细胞会逐渐退化，表现为串联电阻增加。当出现此情况时，应终止实验或对另一个肌细胞进行膜片钳记录。所有记录均应在一小时内完成。

一旦掌握了一对记录，可在一到一个半小时内完成记录。还可能在邻近的节段中获得一到两对额外的记录。典型的一天记录可产生两到三对记录。

成对的运动神经元与骨骼肌记录为研究神经肌肉传递的基本机制提供了独特的机会。当与运动缺陷突变型斑马鱼品系联合使用时，该方法可精确定位神经肌肉功能障碍的来源，并为理解诸如转移综合征等人类疾病的发病机制提供新的见解。