适配器，网格蛋白相互作用在体内和体外研究
January 26th, 2011
网格蛋白介导的内吞作用取决于适配器的蛋白质，协调货物选择和网格蛋白外衣大会。在这里，我们描述的程序来研究网格蛋白适配器的物理互动和活细胞成像的方法，作为一种模式使用酵母吞适配器蛋白Sla1p。
在网格蛋白介导的内吞作用过程中，网格蛋白的多面体晶格通过网格蛋白结合适应蛋白（如 SL one、SL one）通过其变体网格蛋白盒或 VCB 结合网格蛋白。在本视频中，使用了三种方法分析网格蛋白 SLA one 相互作用。首先，使用转盘共聚焦显微镜对表达 GFP 标记的天然和 VCB 突变突变体 SLA one 的酵母细胞进行成像。
然后分析延时电影以确定突变对内吞动力学的影响。其次，从野生型细胞制备酵母胞质提取物作为网格蛋白的来源，并进行 G-S-T-V-C-B 融合蛋白下拉测定以检查网格蛋白 VCB 在体外的相互作用。第三种，从表达天然和 VCB 突变体的酵母细胞制备总提取物。
进行 SLA one 和 coun 沉淀以检查 SLA one 网格蛋白结合在体内亲和力的有效突变。最终，获得的数据表明 VCB 的突变会延迟内吞作用，并且 SLA 1 与网格蛋白的结合丢失。在这些突变体中，尽管这种方法可以提供对内吞作用中咔嗒声接头蛋白动力学的见解。
它也可以应用于分泌途径中囊泡内的其他蛋白质相互作用。通常，个人知道这种方法会很困难，因为光漂白会削弱来自内源性基因座的标记蛋白的低表达的荧光信号。因为该方案将图像分析与物理相互作用的生化研究相结合，所以它是研究控制内吞作用机制的非常有效的方法 为了研究内吞作用过程中网格蛋白衔接子的相互作用，产生了表达网格蛋白适应蛋白 SL 的天然和突变版本的酵母菌株 首先将 GFP 标签添加到 SL 一个 C 末端通过同源重组。
接下来，通过使用含有具有特异性 SL one 侧翼序列的 RA 3 基因的片段选择性地破坏 SLA one 基因来生成中间酵母菌株，以从染色体基因座再生用于表达突变体 SL one 的功能基因。URA three 被包含网格蛋白结合基序或 VCB 的 SL one 片段取代，其中点突变已掺入 VCB 中。然后将所得酵母菌株用于 SLA one 动力学的显微分析。
在内吞位点，采用类似的方法在未标记的 SLA one 菌株（如 TVY 6 1 14）中引入 VCB 突变，其适用于生化实验，首先在 4 毫升补充的 SD 培养基中培养酵母菌株 SLA one GFP 和 SLA one 突变菌株 SLA one A-A-A-G-F-P 在 30 摄氏度的旋转器中在黑暗中旋转。一旦酵母达到 0.1 至 0.4 的 OD 600，将每种培养物转移 1 毫升到微量离心管中，并在室温下以 4， 000 G 离心 1 分钟，离心后丢弃约 950 微升 SUP 纳脱剂，将细胞重悬于剩余液体中，应约为 50 微升。将 3 微升细胞悬液沉积在显微镜载玻片上，并用玻璃盖玻片盖住。
保护样品免受聚焦显微镜上旋转盘上的光线照射。将载玻片安装在 100 x 油浸物镜上。使用明场照明或带有适当滤光片的 488 纳米激光定位正确的焦平面，以激发和检测 GFP，以 500 毫秒的曝光时间为 500 毫秒，以每秒一张图像的间隔捕获 SLA one GFP 和 SLA one A-A-A-G-F-P，持续 150 秒。
GFP 标记的 Punte 将出现在质膜的内表面。持续几秒钟并向细胞中心移动，因为信号迅速消失，表明涂层脱落。使用该软件，选择野生型 SLA 一个 GFP 的延时图像的一部分，其中可以看到斑点。
停留几秒钟，然后消失。为延时图像的每一帧裁剪图像的此部分。接下来，使用该软件生成一个钟声图，表示第 152 个延时图像的每一帧中的这一部分，方法是沿对应于此处经过的时间的轴对齐，这是使用 Adobe Photoshop 演示的。
通过手动计算每个点存在的延时帧数来计算每个点的停留时间。在钟声图中，将调查结果记录在电子表格中。请注意，当每个点消失时，它都应该向细胞内部弯曲。
反映外套的内吞作用和分解。分析每个细胞的 5 个斑点，大约需要 40 个细胞。然后使用 SLA one A-A-A-G-F-P 重复此过程，以获得用于 GST 蛋白亲和测定的酵母胞质提取物。
首先根据随附文本中的说明准备 3 升适当的酵母菌株。将沉淀重悬于 3 至 5 毫升无菌水中，并上下抚摸，直到沉淀完全重悬。接下来，将约 150 毫升液氮倒入 250 毫升塑料烧杯中。闪光。
将酵母以圆周状滴加到液氮中，使其冷冻。为避免结块，请勿让颗粒解冻，添加更多液氮 如有必要，将液氮倒入不锈钢搅拌容器中冷却。让液氮几乎完全蒸发。
然后加入冷冻酵母颗粒。用冷橡胶塞关闭搅拌机，将酵母颗粒研磨 10 秒钟。倒置 3 到 4 次以混合内容物，然后重复研磨步骤两倍。
冷冻酵母将具有粉末状外观的冷却漏斗，带有一个 50 毫升装有液氮的锥形管。使用冷漏斗，将研磨的酵母转移到试管中。冷冻研磨的酵母可以在零下 80 摄氏度下储存或立即使用。
为了获得胞质提取物，在 15 毫升锥形管中称取 3 克冷冻研磨的 TV Y 6 1 4 酵母，并在 3 毫升室温下复苏悬浮。缓冲液 a 含有蛋白酶抑制剂混合物帽，并将试管倒置数次，直到内容物完全解冻。将其放在冰上。
在4 摄氏度下以 300， 000 G 的离心力将提取物超速离心 20 分钟，旋转后，使用 perpet 小心地将旋后或胞质提取物转移到冰上的锥形管中。切开 200 微升尖端的末端，然后用它在缓冲液 A 中加入 100 微升 50% 谷胱甘肽球浆液到胞质提取物中。样品旋转 15 分钟后，将试管放在 4 摄氏度的旋转器上。
通过在 4 摄氏度下离心 2 分钟以 1000 G 的速度旋转珠子，将胞质提取物 snat 转移到新试管中，为输入对照样品保留 50 μL。此时不建议冻结。始终将提取物放在冰上并继续实验。
要进行 GST 融合蛋白亲和测定，在缓冲液 A 中加入 1 毫升 PBS、30 微升 50% 谷胱甘肽球浆液和 50 微克透析的 G-S-T-G-S-T-V-C-B 或突变体 G-S-T-V-C-B 到标记的离心管中。将室温旋转 30 分钟以允许粘合。用 PBS 洗涤珠子两次，用缓冲液离心机洗涤一次。
每次洗涤后以 5， 000 G 浓度 10 秒，然后加入 1 毫升酵母胞质提取物。样品旋转 1 小时后，将试管放在 4 摄氏度的旋转器上。通过在 4 摄氏度下离心 10 秒在 5， 000 G.下离心珠子 3 次，每次洗涤后，用含有 0.1%tritton X 101 次的缓冲液 A 和缓冲液 A 在 4 摄氏度下离心 10 秒。
最后一次旋转后 5， 000 G。使用凝胶上样尖端去除尽可能多的液体。此时，样品可以储存在零下 20 摄氏度。
为了稍后继续，向每个试管中加入 15 毫升 2 倍 lamb lee 样品缓冲液。将样品放在加热块上，在 96 摄氏度下孵育 5 分钟。然后以 5， 000 G 的离心力将样品离心 10 秒，将样品带到试管底部。
使用抗网格蛋白重链的抗体通过免疫印迹分析样品，以获得用于共沉淀实验的总细胞提取物。与之前一样，使用表达野生型 SL one 的菌株 TVY six 14 制备冷冻研磨酵母样品，SL one A A 菌株携带 L-L-D-L-Q 至 A-A-A-L-Q 突变在 TY six 14 中。背景和携带 SL one 基因缺失的 SL one delta 菌株，例如 GPY 3 1 3 0 方式。
两克冷冻研磨酵母，装在锥形管和牛来香肠中。将它们悬浮在 2 毫升室温缓冲液 a 中，其中含有蛋白酶抑制剂混合物和 2%triton X 100 帽，并将试管倒置数次直至完全解冻，然后在冰上孵育 10 分钟。周期性倒置混合。
将材料转移到微量离心管中，并在 4 摄氏度下以 16， 000 旋转 15 分钟。G 小心地不要打扰颗粒。将 sup、natant 或总细胞提取物转移到冰上的锥形管中。
使用移液管加入 100 微升 50% 蛋白质，在缓冲液中加入球状浆液，在 4 摄氏度下旋转 15 分钟。然后以 4 °C 的 1000 G 离心 2 分钟，将磁珠离心下来，并将 S 上清液转移到新试管中。保留 50 微升提取物用于输入控制 进行免疫共沉淀测定。
添加 1 毫升 PBS 30 微升 50% 蛋白质。缓冲液 A 中的球状浆液和两微克兔抗 SLA。一种针对标记的微量离心管的抗体。
在室温下旋转 30 分钟。用 PBS 洗涤珠子两次，用缓冲液洗涤一次。A 含有 1%tritton X 100。
加入 1 毫升总酵母提取物。SLA 1、SLA 1 A A 和 SLA 1 delta。在 4 摄氏度下旋转 1 小时。
以 5， 000 G 离心 10 秒，以在离心后沉淀珠子。弃去 SUP 纳脱剂，用含有 0.1% Tritan X 101 次的缓冲液 A 快速洗涤珠子 3 次。再次旋转珠子并使用凝胶加载尖端，去除尽可能多的液体。
此时，样品可以储存在零下 20 摄氏度。要稍后继续，请向每个试管中加入 15 微升 2 倍 laly 样品缓冲液。在 96 摄氏度下孵育 5 分钟，然后在 5， 000 G 下旋转 10 秒。这里。
在左侧比较了野生型和突变型 SL 1 的活细胞成像结果。单个酵母细胞的 SLA 显示，细胞外围的一个阳性内吞区域显示为绿色。白线之间的区域对应于生成亮色上显示的移植物的区域。
请注意，突变体中的内吞位点持续的时间明显更长，比野生型约 80 秒，约为 30 秒，表明外壳形成有缺陷。网格蛋白和 SLAA one 变体网格蛋白盒之间的物理相互作用通过 GST 融合蛋白进行评估。亲和测定，GST 与 SLA 一个片段 AA 7 98 至 8 1 3 融合，其中包含序列 L-L-D-L-Q。
将相应的 A-A-A-L-Q 突变体或单独的 GST 与谷胱甘肽、浆液珠结合，并与野生型酵母细胞的胞质提取物一起孵育。如图所示，通过免疫印迹法对网格蛋白重链进行相关蛋白的分析。网格蛋白与 G-S-T-V-C-B 结合 GST 或 G-S-T-V-C-B 突变体，表明 SLA one 与网格蛋白结合需要一个完整的变体网格蛋白盒。
在尝试此程序时，请务必始终靠近火焰工作，以避免污染 GS 培养物。遵循此程序。可以进行其他荧光蛋白（如 RFP）的标记以检查不同蛋白质的共定位。观看此视频后，您应该对如何使用生化和荧光细胞成像技术研究蛋白质蛋白质相互作用有很好的了解。
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概述
本研究聚焦于网格蛋白介导的内吞作用，强调适配蛋白在货物选择和网格蛋白外壳组装中的作用。使用酵母内吞适配蛋白Sla1p，采用多种方法来分析适配蛋白-网格蛋白的相互作用和活细胞成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 生物化学
背景
- 网格蛋白介导的内吞作用对细胞过程至关重要。
- 适配蛋白将网格蛋白与膜蛋白或脂质连接。
- Sla1p是酵母中的关键适配蛋白。
- 理解这些相互作用可以揭示内吞机制的洞见。
研究目的
- 调查Sla1p和网格蛋白之间的物理相互作用。
- 分析突变对内吞动力学的影响。
- 利用活细胞成像技术进行实时观察。
使用的方法
- 旋转圆盘共聚焦显微镜用于成像表达GFP标记的Sla1p的酵母细胞。
- 时间跃迁电影评估VCB突变对内吞的影响。
- 使用酵母细胞质提取物的下拉试验在体外研究网格蛋白相互作用。
- 制备酵母细胞总提取物以供进一步分析。
主要结果
- 活体成像显示由于突变而导致的内吞动力学的差异。
- 体外试验确认了网格蛋白和Sla1p之间的相互作用。
- GFP标记允许在活细胞中可视化Sla1p动态。
- 结果有助于理解适配蛋白在内吞中的作用。
结论
- 像Sla1p这样的适配蛋白对网格蛋白介导的内吞至关重要。
- 突变可以显著影响内吞的动力学。
- 活细胞成像是研究蛋白质相互作用的强大工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding adaptor-clathrin interactions is critical for de-risking target validation in early discovery by clarifying mechanistic pathways of cellular uptake. This approach supports predictive confidence in lead identification by enabling quantitative assessment of protein-protein interactions that influence compound accessibility and target engagement. The integration of live-cell imaging with biochemical assays provides a reusable platform for screening and assay development in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by clarifying how adaptor proteins link clathrin to membrane cargo, informing target accessibility.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct measurement of adaptor-clathrin binding affinity using GST-pull down and co-immunoprecipitation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking endocytic kinetics to mechanistic de-risking of cellular entry mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing reliable readouts of adaptor-clathrin interaction dynamics.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through time-lapse imaging and quantitative dwell time analysis of endocytic sites.
- Screening Readiness: Highlights scalability and platform reuse by combining live-cell imaging with in vitro binding assays for compound effect evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by positioning endocytic adaptor function as a biomarker-aligned process in cellular trafficking pathways.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by connecting adaptor mutation effects to functional outcomes in vesicle formation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions by measuring how mutations alter coat assembly kinetics, informing target confidence in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, where understanding endocytic mechanisms informs compound design and target selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing adaptor dynamics at endocytic sites and quantifying coat disassembly timing.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible quantification of endocytic site persistence and fluorescence signal loss over time.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as dwell time measurements and binding affinity shifts that enable comparison between wild-type and mutant conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking adaptor-clathrin interaction strength to functional endocytic efficiency in live cells.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for studying protein-protein interactions in vesicle trafficking across multiple target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in cellular uptake mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of imaging and biochemical readouts across experimental replicates.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying trafficking liabilities early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated endocytic pathway engagement.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in yeast genetics, fluorescence microscopy, and protein interaction assays.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including spinning disc confocal microscopy, centrifuges, and blotting systems.
- Cross-team standardization requirements for image analysis protocols and binding assay quantification.
- Adaptation considerations across model systems, noting yeast-specific genetics may require orthogonal validation in mammalian cells.
- Practical limitations include photobleaching of fluorescent signals and dependence on endogenous expression levels for accurate localization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
1:34
Introduction
2:10
Generation of GFP-tagged Sla1 and Sla1 Clatherin-binding Mutant Yeast Strains
5:09
Fluorescence Image Analysis
3:22
Fluorescence Microscopy
6:41
Preparation of Yeast Cytosolic Extract
11:53
Preparation of Total Cell Extract
9:54
GST-fusion Protein Affinity Assay
13:36
Co-immunoprecipitation Assay
15:16
Representative Results
16:39
Conclusion
