生产的灭鼠疟疾寄生虫的遗传交叉议定书"
2011年1月3日
啮齿类动物疟疾寄生虫的基因杂交进行喂养蚊子的两个基因的不同的寄生虫。克隆小鼠血液，让蚊虫叮咬感染小鼠后，重组的后代。本视频演示了如何产生遗传杂交约氏疟原虫，并适用于其他啮齿类动物疟疾寄生虫。
该程序的总体目标是产生啮齿类疟疾寄生虫疟原虫 yoi 的遗传杂交，以产生重组后代。这是通过首先给一组小鼠注射含有要杂交的寄生虫的两个亲本克隆的混合接种物来实现的。然后用受感染的小鼠在里面喂食蚊子，每个亲本菌株的 gat 会融合成二倍体合子肌分裂，在这个阶段会导致基因重组，从而产生重组后代。
然后从蚊子唾液腺中收获所得的子孢子，并重新注射到幼稚的受体小鼠中，以获得血液阶段的寄生虫，其中包括可以通过有限稀释分离的单个重组克隆。在成功的实验中，5% 至 10% 的克隆品系将是重组体，这可以通过对适当的遗传标记进行基因分型来表征。这种方法可以帮助回答疟疾研究领域的关键问题，例如疟疾耐药性蚂蚁和传播性的遗传决定因素是什么？
寄生虫 在室温下，两个小瓶含有冷冻血液阶段，疟疾寄生虫要交叉。在这个例子中，使用的两种啮齿类疟疾寄生虫菌株是 yoi 疟原虫、oi 疟原虫和疟原虫。Yoi 尼日利亚人用 22 至 30 号针头安装注射器，并使用相同的注射器吸入 400 微升 pH 7.4 的 PBS。
抽取 100 微升 Thor 感染的血液，上下倒置注射器，直到内容物均匀混合。在此演示期间，将使用麻醉的动物以减轻疼痛和压力。通过将 50 微升麻醉药物混合物（每公斤氯胺酮含有 82.5 毫克）和每公斤甲苯噻嗪 7.5 毫克注射到小鼠的腹膜中进行麻醉。
监测小鼠的麻醉深度并防止死亡。使用该程序，小鼠将在麻醉下保持 20 至 30 分钟。恢复前，将 200 微升含寄生虫的溶液直接注射到小鼠的腹膜中。
完成后，以急剧旋转的方式丢弃注射器。使用这种方法，用两种寄生虫引流管感染两只小鼠，在注射后 3 到 5 天交叉。血液期寄生虫会在受感染的小鼠中发展。
用无菌剪刀夹住感染不同寄生虫菌株的供体小鼠的小鼠尾尖。在显微镜载玻片上收集一滴小鼠尾血并进行薄涂片。用吉列姆染色剂对薄血涂片进行染色。
由于未感染的细胞，Guillem SA 染料不会对未感染的红细胞进行染色。缺乏细胞核 em SAI 会使受感染的红细胞寄生细胞中的寄生细胞核染色，红细胞以环期、滋养体、滑落体和破裂的 maites 的形式出现。一旦两只小鼠的副贫血达到 1% 至 5%，就可以收获血液阶段的寄生虫用于混合克隆感染。
夹住感染不同寄生虫的供体小鼠的小鼠尾尖。如前所述，用无菌剪刀拉伤。使用玻璃毛细管在 1 毫升无菌 PBS 中收集 1 微升小鼠尾血，使用 20 微升血液悬浮液分析红细胞密度和细胞组。
使用红细胞密度和对位测量，在生理柠檬酸盐盐水溶液中稀释血液样品，以获得每 100 微升 100 万个感染红细胞的浓度。将来自两个供体的感染血液样品以一比一的比例混合，以获得混合克隆接种物。接下来，将 100 微升混合样品注射到每只待感染小鼠的腹膜中。
使用两只小鼠进行单克隆感染，以确认每种亲本菌株的成功传播。称为雄性和雌性配子体的寄生虫的性阶段应该在感染后四天左右开始出现在小鼠的血液中。如前所述，通过收集尾血并准备 em 持续的薄血尾涂片，开始每天监测小鼠配子细胞的外观。
由于存在大颗粒或色素，雄性和雌性细胞是可识别的。雄性 gato 位点的细胞质为粉红色，而雌性 TER 位点的细胞质为蓝色。只有成熟的 gato 位点才会呈现一个大液泡。
一旦检测到两性的成熟细胞，就可以用小鼠来喂食蚊子。将 50 微升氯胺酮、甲苯噻嗪和麻醉溶液注射到每只感染小鼠的腹膜中。麻醉小鼠后，将一个面朝下的笼子放在装有 50 到 100 只雌性茴香防御酶蚊子的笼子顶部，这些蚊子已经缺乏糖分供应 24 小时，并让蚊子不间断地进食 30 分钟。
在喂食期后立即对小鼠进行人道安乐死。如果传播成功，在喂食后 9 天，蚊子吸收的配子体将融合成二倍体受精卵，这些受精卵成熟为卵囊，这可以在昆虫的中肠中看到。检测到的卵囊越多，产生重组寄生虫的可能性就越高。
使用抽吸器从笼子中收集 5 到 10 只受感染的蚊子，然后将蚊子转移到一个小容器中。使用二氧化碳气体麻醉蚊子，并将它们转移到冰上的玻璃培养皿中。触角明显比雌性更浓密的雄性蚊子被丢弃。
用 PBS 填充两个注射器，并安装 26 号半英寸针头。将注射器中约 100 微升 PBS 沉积到载玻片上。将 5 到 10 只麻醉的雌性蚊子转移到 PBS 滴剂上，并使用针头将载玻片放在解剖显微镜上。
去除每只蚊子的翅膀和腿，然后将昆虫放在胸部和后腹部。将身体拉开，直到中肠释放出一个白色的麻袋状身体。在进行解剖时，分离中肠并丢弃身体的其余部分。
请务必使用解剖针中的 PBS 保持中肠湿润。解剖完成后，将盖玻片盖在中肠上。在光学显微镜下以 100 倍放大倍数检查中肠。
OOS 将被识别为位于中肠外表面的厚壁圆形结构。计算每个中肠中 OOS 的数量。喂食后 17 天，从 SYS 释放的子孢子应该已经迁移到蚊子 SIV 腺，疟疾寄生虫的子孢子。
薄的纺锤形细胞用于收获子孢子。首先，使用干净的剪刀准备收集管。切掉 500 μL 小 einor 管的盖子。
加热无菌 19 号针头的尖端并刺穿管底。用玻璃壁填充管的三分之一以形成过滤器。将过滤管插入较大的 1.5 毫升 einor 管中。
过滤装置准备好后，如前所述收集和麻醉蚊子。像以前一样将昆虫气挂进行解剖，并去除留下的蚊子、头部、翅膀、腿部和腹部。只有胸部包含受感染的 siv 腺。
使用细尖镊子，将胸部转移到含有 500 微升 PBS 的 1.5 毫升匀浆器中。在冰上匀浆胸部以从唾液腺中释放子孢子，并使用玻璃移液管将匀浆转移到过滤装置中。以每分钟 1000 转的速度离心过滤管 10 至 20 秒。
匀浆离心后，使用装有 22 至 30 号针头的注射器收集流过。将 100 至 500 微升子孢子悬浮液注射到小鼠的腹膜中。感染后 3 天开始监测小鼠的 para 和红细胞密度。
选择一只显示 0.1% 至 1%para 且其感染的红细胞主要含有单一寄生虫的小鼠作为克隆程序的供体。在 PBS 中抽取适量的血液，在小牛、血清和哺乳动物林格液的冷一对一溶液中稀释小鼠尾血，以达到每 100 微升 0.6 至 1 个感染红细胞的浓度，并将接种物储存在冰上。用乙醇静脉注射清洁尾部的注射部位。
向 100 只小鼠中的每一只小鼠注射 100 微升稀释的感染血液。以这种方式，每只小鼠应接收一个或零个寄生虫。在成功的实验中，20% 至 50% 的小鼠在第 8 天将显示 0.1% 至 0.5% 的 para。
5 到 7 天后，通过检查 Gem 持续的薄血涂片来筛选小鼠是否存在血液期寄生虫。然后可以通过 DNA PCR 对来自杂交的寄生虫进行基因分型，使用 DNA 上的遗传标记（如微卫星和单核苷酸多态性）从尾血样本中提取。独立遗传位点来源于两个亲本克隆的寄生虫是重组克隆。
感染重组寄生虫的动物的血液可以冷冻保存以备将来使用。在成功的实验中，总小鼠的 5% 到 10% 将具有独立的重组后代。看完这个视频，你应该对疟疾如何产生遗传过程有了很好的了解。
寄生虫加中等 yoi。这种方法同样适用于其他种类的寄生虫。
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概述
该视频演示了产生啮齿动物疟疾寄生虫Plasmodium yoelii遗传交配以产生重组子代的程序。该方法涉及用受感染的小鼠喂养蚊子以促进遗传重组。
关键研究组成部分
科学领域
- 疟疾研究
- 遗传重组
- 寄生虫学
背景
- 啮齿动物疟疾寄生虫可以进行遗传交配以研究其遗传学。
- 了解遗传决定因素对疟疾研究至关重要。
- 重组子代可以提供对药物抗性和传染性的见解。
- 这种方法可以应用于各种啮齿动物疟疾物种。
研究目的
- 产生Plasmodium yoelii的遗传交配。
- 产生重组子代以进行进一步分析。
- 研究影响疟疾特征的遗传因素。
使用的方法
- 向小鼠注射两种亲本克隆的混合接种物。
- 用受感染的小鼠喂养蚊子以促进接合子的形成。
- 从蚊子唾液腺中收集虫孢子。
- 将虫孢子重新注射到未经接种的小鼠中以获得血液期寄生虫。
主要结果
- 成功产生遗传交配的重组子代。
- 通过基因分型对重组克隆进行表征。
- 识别5-10%的克隆系为重组体。
- 对药物抗性和传染性遗传决定因素的见解。
结论
- 该方法对疟疾研究中产生遗传交配是有效的。
- 重组子代可以帮助回答该领域的关键问题。
- 这种方法可以适用于其他啮齿动物疟疾寄生虫。
常见问题
Executive Industry Relevance
Genetic crossing of rodent malaria parasites enables systematic interrogation of genotype-phenotype relationships in a tractable model system. This approach supports target validation by linking genetic loci to phenotypes such as drug resistance and transmissibility, providing mechanistic de-risking for downstream therapeutic hypotheses. The method generates recombinant progeny for high-resolution mapping, accelerating lead identification in antiparasitic discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by associating genetic loci with phenotypic traits like drug resistance.
- Operational Value: Produces recombinant progeny that clarify biological mechanisms underlying parasite virulence and drug response.
- Scientific Value: Supports predictive confidence through linkage mapping of traits to specific genomic regions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates genetically diverse parasite lines for phenotypic screening against compound libraries.
- Operational Value: Establishes standardized biological systems with quantifiable outputs for assay reproducibility.
- Scientific Value: Enables preparation of clonal parasite populations for reliable compound evaluation in blood-stage assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by reproducing key biological characteristics of human malaria parasites.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation using isogenic recombinant lines.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by identifying genetic determinants of transmissibility and drug susceptibility.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation by generating defined genetic diversity for phenotypic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling genetic recombination between phenotypically distinct parental strains.
- Screening: Delivers assay-ready recombinant progeny with standardized genetic backgrounds for compound screening campaigns.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements through genotyping of recombinant clones using microsatellite and SNP markers.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by producing parasite lines that model human malaria parasite traits relevant to therapeutic intervention.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating genetic diversity across multiple rodent malaria species and phenotypic traits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in genotype-phenotype mapping.
- Operational Value: Standardization and scalability of recombinant parasite production for consistent screening inputs.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via early de-risking of targets based on genetic evidence from controlled crosses.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of leads supported by genetic evidence of trait inheritance and penetrance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in parasite culture, mosquito handling, and genetic genotyping techniques.
- Dependent on animal facilities for mouse and mosquito maintenance and controlled infection protocols.
- Necessitates standardization across teams for parasite cloning, genotyping, and phenotypic assessment.
- Adaptation considerations include species-specific differences in gametocyte development and mosquito compatibility.
- Practical limitations include dependency on successful mosquito feeding and oocyst development for recombinant yield.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Introduction
1:37
Infection of Laboratory Mice with Blood-Stage Malaria Parasites
4:06
Mixed Clone Infection of Mice
5:14
Feeding Mosquitoes
6:45
Dissecting Mosquito Midget and Counting Oocysts
8:58
Collecting Sporozoites from Mosquitoes by Centrifugation
10:56
Cloning Progeny from a Genetic Cross Using Limiting Dilution
12:57
Production of Recombinant Malaria Parasites by Genetic Cross
13:11
Conclusion
