Name: 生产的灭鼠疟疾寄生虫的遗传交叉议定书 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: 学习利用Plasmodium yoelii进行鼠疟原虫遗传杂交的方法，通过蚊媒传播和孢子虫分离获得重组后代。该技术有助于研究疟疾耐药性及传播性的遗传决定因素，为寄生虫学研究提供重要工具。

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感谢Randy Elkins博士、Robin Kastenmayer博士、Ted Torrey博士、Dan Pare博士和Tovi Lehman博士对稿件的审阅。本研究得到了美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所所内研究计划所内研究部、美国国立卫生研究院以及中国国家重点基础研究发展计划（973计划，项目编号：2007CB513103）的支持。感谢美国国立过敏与传染病研究所所内编辑Brenda Rae Marshall提供的协助。

所有施用于动物的材料均须采用无菌技术，以避免将外源性感染因子意外引入小鼠体内，从而干扰实验结果。

1. 实验小鼠红内期疟原虫感染
<ol>
<li>在室温下，解冻两管待杂交的冻存疟原虫红内期样本。本示例中使用的两种鼠疟原虫株分别为 Plasmodium yoelii yoelii 和 Plasmodium yoelii nigeriensis。</li>
<li>将一支注射器安装22–30号（G）针头，并抽取400 μL无菌级药用PBS（pH 7.4）。</li>
<li>使用同一支注射器，再抽取100 μL解冻后的感染血液；将注射器上下颠倒，使内容物充分混匀。（可选：可使用移液器先将PBS和感染血液转移至收集管中，再转入注射器用于注射）。</li>
<li>将200 μL含疟原虫的溶液直接注射入小鼠腹腔。操作完成后，将注射器丢弃至锐器盒中。（有关实验小鼠的饲养管理，参见补充材料）。通常，接种量的标准体积为100–500 μL，具体取决于原始冻存材料中的寄生虫感染水平。</li>
<li>将待杂交的两种疟原虫株分别注射至两只小鼠体内。注射后3至5天，小鼠在显微镜下可检出阳性。当寄生率达到1%–5%时，继续进行下一步操作。</li>
</ol>
2. 小鼠混合克隆感染
<ol>
<li>在进行混合克隆感染之前，采集分别感染了不同寄生虫株的两只供体小鼠的尾部血液，通过吉姆萨染色的薄血涂片进行显微镜检查（见图3），并测定红细胞密度（详细操作步骤见补充材料）。</li>
<li>根据先前获得的寄生虫血症水平和红细胞密度测量结果，计算制备接种混合液所需的生理盐水（1.5% w/v 三水合柠檬酸钠，0.85% w/v 氯化钠）和小鼠血液的体积。</li>
<li>将寄生虫溶液调整至最终浓度为每100μl含有一百万个感染红细胞。</li>
<li>按1:1比例混合来自两个供体的感染血液，获得混合克隆接种物。当两个亲本克隆的生长速率不同时，将生长较快的亲本克隆与生长较慢的亲本克隆的比例调整为1:2或1:5。</li>
<li>向每只待感染小鼠腹腔注射100 μL混合样品。（另见步骤3.9以确定需注射的小鼠数量）</li>
<li>使用该方法，分别用单一亲本株感染两只小鼠。单克隆感染可用于确认两个亲本株是否成功传播。</li>
</ol>
3. 喂食蚊子
<ol>
<li>准备三个笼子，每个笼子中放入300–500只成年（雄性和雌性）斯氏按蚊（Anopheles stephensi），蚊虫羽化后年龄为5–7天。笼子用网罩覆盖，并用塑料或金属盖固定。其中两个笼子用于亲本克隆的喂养，第三个笼子用于遗传杂交的准备。</li>
<li>从混合克隆感染后的第四天开始，制备感染小鼠的吉姆萨染色薄血膜涂片。</li>
<li>在显微镜下检查涂片，以1000倍放大倍数至少扫描50个显微视野，确定是否存在雄性和雌性配子体。</li>
<li>雄性和雌性配子体可通过其含有大空泡和大颗粒的特征进行识别（图3）。雄性和雌性配子体的胞质分别呈粉红色和蓝色。若观察到配子体，则进行步骤3.6。</li>
<li>若未观察到配子体，则需每日持续监测直至其出现。若已观察到配子体，则继续下一步操作。</li>
<li>将含有33 mg/mL氯胺酮和3 mg/mL赛拉嗪的麻醉剂混合液50 μL注射至小鼠腹腔内，以麻醉每只感染小鼠（按每20克小鼠体重计算）。氯胺酮和赛拉嗪的最终剂量分别为82.5 mg/kg和7.5 mg/kg。</li>
<li>将小鼠腹部朝下放置在装有成年斯氏按蚊的笼子上方，这些蚊虫已停止糖源供应24小时。让蚊虫连续自由吸血30分钟，期间不得干扰。</li>
<li>将蚊虫置于昆虫饲养室中，在标准条件下维持培养（温度保持在24–26°C；实验室蚊虫的维持方法另见补充方法部分）。</li>
<li>每50–100只雌蚊使用一只感染小鼠。喂食结束后，在小鼠仍处于麻醉状态下立即通过颈椎脱位法实施安乐死。</li>
</ol>
4. 解剖蚊子中肠并计数卵囊
<ol>
<li>喂食后第九天，检查蚊子中肠内的卵囊。若蚊子取食单克隆感染的小鼠后体内出现卵囊，表明两种亲本株的配子体均具有感染性。</li>
<li>使用连接至小型容器的吸虫器，从笼中收集5至10只感染的蚊子用于解剖中肠。</li>
<li>用CO2气体麻醉蚊子，并将其转移至置于冰上的玻璃培养皿中。将雄蚊与雌蚊分离并丢弃雄蚊。雄蚊触角明显比雌蚊更浓密。</li>
<li>用PBS填充两支注射器，并安装26号半英寸（G½）针头。从注射器中挤出约100 μL PBS滴于载玻片上。</li>
<li>将5至10只麻醉后的雌蚊转移至PBS液滴中，并将载玻片置于解剖显微镜下。</li>
<li>使用相同的针头去除每只蚊子的翅膀和腿，然后用针头夹住胸部和腹部后端，将蚊体拉开，使中肠（呈白色囊状结构）释放出来。分离中肠，丢弃其余身体部分。</li>
<li>若载玻片干燥，需向中肠补充PBS。中肠若暴露干燥会迅速降解。将盖玻片覆盖在中肠上。</li>
<li>在光学显微镜下以100倍放大倍数观察中肠。计数每个中肠内的卵囊数量（图3）。卵囊为厚壁圆形结构，位于中肠外表面，易于识别。</li>
<li>操作结束后，将注射器、针头和载玻片丢弃至锐器盒中。</li>
<li>若中肠内未观察到卵囊，应使用配子体数量更高的感染小鼠重新喂食蚊子，并延长喂食时间。此步骤对温度极为敏感，务必确保温度维持在24至26°C。</li>
</ol>
5. 通过离心法从蚊子中收集子孢子
<ol>
<li>按如下步骤准备子孢子收集管：取一个洁净的 0.5-mL 离心管，剪下管盖，并用灼烧过的 19 G 针头在管底打一个直径为 0.1–0.2 mm 的小孔。</li>
<li>用玻璃棉填充管子的三分之一。将滤管插入一个 1.5-mL 收集管中（一个收集管足以从约 100 只蚊子中收获子孢子）。</li>
<li>在喂食后第 17 天，使用吸蚊器将蚊子（步骤 4）从笼中收集到一个小容器中。</li>
<li>使用 CO2 气体麻醉蚊子。</li>
<li>将雌蚊与雄蚊分离。将麻醉后的雌蚊从容器转移到置于冰上的玻璃培养皿中。</li>
<li>准备两支装有 PBS 的 26 G½ 针头注射器。从注射器中滴加约 100 μL PBS 到载玻片上。</li>
<li>将蚊子转移到显微镜载物片上。在解剖显微镜下移除蚊子的头部、翅膀、腿和腹部。</li>
<li>使用精细镊子将胸部组织转移到 1.5-mL 匀浆器（研钵和研杵）中的 0.5 mL PBS 中。将胸部组织置于冰上保存（子孢子在 2–3 小时内仍保持感染性）。</li>
<li>在冰上匀浆胸部组织以从唾液腺中释放子孢子（见图 3），并使用玻璃移液管将裂解液（匀浆液）转移至装有玻璃棉的管中（步骤 5.1–5.2）。</li>
<li>在室温下以 1000 rpm 离心 10 至 20 秒。</li>
<li>使用 22–30 G 针头的注射器收集穿过滤层的液体（即纯化的子孢子悬液）。（可选：将 10–50 μL 滤过液滴加到显微载玻片上，加盖盖玻片，在标准光学显微镜下以 400X 放大倍数观察活体子孢子，参见图 3）</li>
<li>将 0.1–0.5 mL 子孢子悬液腹腔注射至小鼠体内（单只蚊子最多可收获 200,000 个寄生虫；参见参考文献 12）。成功情况下，动物在注射后 72 小时将出现感染。</li>
</ol>
6. 使用有限稀释法克隆子代细胞
<ol>
<li>在子孢子注射后72小时，从感染不同寄生虫株的两只供体小鼠采集尾部血液，经吉姆萨染色薄血涂片后进行显微镜检查，并测定红细胞密度（详细步骤见补充材料）。</li>
<li>选择寄生虫血症水平为0.1%至1%、且感染红细胞中主要为单个寄生虫的小鼠作为克隆实验的供体。若小鼠显微镜下呈阴性，则在接下来的几天重复步骤6.1。若动物在14天内未被感染，则重复步骤2至5，并在步骤5.11中确认子孢子的存在。</li>
<li>将采集的尾部血液用冰冷的犊牛血清与哺乳动物林格氏液（2.7 mM 氯化钾、1.8 mM 氯化钙、154 mM 氯化钠）按1:1比例混合的溶液稀释，使终浓度达到每100 μL含0.6至1个感染红细胞，并将接种液置于冰上保存。通过此方法，大多数小鼠个体接收到的寄生虫数量为一个或零个。</li>
<li>将100 μL稀释后的感染血液经静脉注射至50至100只小鼠中。</li>
<li>5至7天后，通过检查吉姆萨染色薄血涂片来筛查小鼠血液阶段寄生虫的存在。在成功的实验中，20%-50%的小鼠会被感染，并在感染后第8天表现出0.1%-5.0%的寄生虫血症水平。</li>
</ol>
7. 使用遗传标记对子代进行表征
<ol>
<li>在含有0.2 mL冷生理柠檬酸盐溶液的1.5 mL微量离心管中收集20至40 μL小鼠尾部血液，短暂涡旋混匀，然后在室温下以3000 rpm离心3分钟，使血细胞沉淀。立即提取DNA，或将沉淀物保存于-80°C。</li>
<li>采用任何标准DNA提取方法制备寄生虫DNA。为快速分离DNA，可使用High Pure PCR模板制备试剂盒（Roche Applied Bioscience）。</li>
<li>通过在不同染色体上对能够区分遗传杂交双亲株的微卫星（MS）或单核苷酸多态性（SNP）进行基因分型，鉴定重组子代。可采用一种简化的微卫星基因分型方法，使用单荧光标记引物对P. yoelii进行检测（参见参考文献8,9）。</li>
</ol>
8. 血液期疟原虫的冷冻保存
<ol>
<li>从寄生虫血症为5-20%的麻醉小鼠中，通过心脏穿刺采集0.5-1 mL血液，并加入5-10 mL预冷的生理盐水中。</li>
<li>在室温下以2000 rpm离心5分钟，弃去上清液。</li>
<li>将两倍体积的Glycerolyte 57溶液（Fenwal Laboratories）逐滴加入血细胞沉淀中，并充分混匀。</li>
<li>将悬液转移至冻存管中（每管0.2-0.5 mL）。</li>
<li>将冷冻保存的血液储存在-80 °C（最长1个月）或液氮中。</li>
</ol>
9. 代表性结果：

在成功的实验中，5-10%的克隆系将为独立的重组后代。

 <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="疟原虫生活周期示意图，显示从蚊媒到啮齿类宿主的各个阶段及遗传过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 遗传杂交过程中生活周期及遗传重组事件的示意图。遗传重组事件发生在蚊体内发育的早期阶段。在蚊子中肠内，不同遗传背景的“单倍体”雌雄配子受精后形成“二倍体”合子。该合子是寄生虫生活周期中唯一的二倍体阶段；受精后约12小时内即进行减数分裂，此后在蚊体和哺乳动物体内所有发育阶段均为单倍体。形成的合子进一步发育为动合子和卵囊。每个卵囊通过生长和有丝分裂可产生数千个子孢子，释放至蚊体血腔中。其中迁移至唾液腺的子孢子可随蚊子叮咬传播至哺乳动物宿主，并在宿主体内发育为肝期和红细胞期。在红细胞期增殖过程中，部分寄生虫可分化为成熟的雄性和雌性配子体。当这些配子体被另一只蚊子摄入后，即完成寄生虫生活周期，实现传播的持续循环。
 <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="寄生虫遗传杂交示意图；减数分裂过程、配子、异体受精、染色体变异。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 疟原虫核基因的遗传及重组子代的产生。遗传重组可通过染色体重新分配或交换事件产生。由同一亲本克隆1或2的配子自体结合产生的纯合子代（分别为A和D）。B）由两个不同亲本克隆的配子异体受精产生的杂合子代，重组核（蓝色椭圆）仅通过染色体重新分配形成。C）由两个不同亲本克隆的配子异体受精产生的杂合子代，重组核（红色椭圆）通过同源染色体的非姐妹染色单体之间的交叉交换形成。
 <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="细胞形态显微图像，图示A-K中各类细胞类型与结构。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 啮齿类疟原虫Plasmodium yoelii的形态学特征。A) 环状体阶段，B) 滋养体，C) 裂殖体，D) 裂殖子，E) 未成熟雄配子体，F) 成熟雄配子体，G) 未成熟雌配子体，H) 成熟雌配子体，I) 饲血后第10天的蚊中肠（箭头指示成熟卵囊；200倍放大），J) 蚊唾液腺（100倍放大），K) 子孢子（400倍放大）。

<ol><li>Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfadoxine-pyrimethamine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).</li>
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</ol>

由于作者为政府雇员，且本作品属于政府工作，因此该作品在美国属于公共领域。尽管存在任何其他协议，美国国立卫生研究院（NIH）保留将该作品提供给PubMedCentral以供公众展示和使用的权利，且PubMedCentral可根据其常规做法对作品进行标记或修改。您可以在美国境外依据政府使用许可确立相关权利。

我们展示了在啮齿类疟原虫Plasmodium yoelii中进行遗传杂交的技术，该方法同样适用于其他啮齿类疟原虫的遗传杂交实验。在进行杂交前，通常需先用单一亲本克隆感染小鼠，以确认亲本寄生虫成功传播，确保亲本具有产生功能性配子的能力。
蚊虫成功传播疟原虫受到多种因素影响，包括昆虫饲养室的温度、所用啮齿类疟原虫的种类以及血液阶段寄生虫的接种剂量（接种量）。虽然通常在19–21°C条件下即可实现P. berghei的传播13，但P. yoelii和P. chabaudi的传播通常在23–25°C下进行14。P. berghei的动合子在低于16°C或高于24°C的温度下无法发育为卵囊15。除温度外，接种量也会影响疟原虫在血液中的增殖速率。尽管注射较大剂量的接种物（5 × 106 个感染性红细胞或更多）可在感染早期产生更高的寄生虫血症，但这并不一定导致更多的配子体数量或更高的蚊虫感染性。Gadsby等人（200...

<table><tbody><tr><td>Glyerolyte 57 溶液</td><td>Cenmed</td><td>4A7833</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 &lt;em&gt;小家鼠&lt;/em&gt;</td><td>查尔斯河实验室</td><td></td><td>雌性，近交系，Balb/C 品系</td></tr><tr><td>热灭活小牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>26010-066</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）溶液</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td>pH 7.4；细胞培养级 </td></tr><tr><td>疟原虫 &lt;em&gt;疟原虫 y&amp;#8211;lii y&amp;#8211;五十二&lt;/em&gt; 17XNL(1.1)</td><td>MR4</td><td>MRA-593</td><td>由 DJ Carucci 提供</td></tr><tr><td>疟原虫 &lt;em&gt;疟原虫 y&amp;#8211;lii nigeriensis&lt;/em&gt; N67</td><td>MR4</td><td>MRA-427</td><td>由 W Peters、BL Robinson、R Killick Kendrick 提供</td></tr><tr><td>蚊子 &lt;em&gt;Anopheles stephensi&lt;/em&gt;</td><td>MR4</td><td>MRA-128</td><td>由 MQ Benedict 沉积</td></tr><tr><td>Cellometer 自动细胞计数仪</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer CP2 一次性血细胞计数板</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer CP2</td><td></td></tr><tr><td>高纯度PCR模板制备试剂盒</td><td>罗氏集团</td><td>11 796 828 001</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>经细胞培养测试；经昆虫细胞培养测试</td></tr><tr><td>改良吉姆萨染色</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GS500</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td> 药品级；浓度达 100 mg/mL</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>经细胞培养测试；经昆虫细胞培养测试</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>经细胞培养测试；经昆虫细胞培养测试</td></tr><tr><td>二水合柠檬酸三钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Akorn 公司</td><td>4811-20ml</td><td>药品级；浓度至20 mg/mL</td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>VWR 国际公司</td><td>32848-003</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管（1 &amp;mu;L</td><td>VWR 国际公司</td><td>53440-001</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>VWR国际</td><td>15170-168</td><td>完整腔室组件</td></tr><tr><td>匀浆器</td><td>VWR 国际公司</td><td>KT749520-0090</td><td>1.5 mL 配套研磨杵与管 </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title&quot;&gt;补充材料：&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;李&gt;实验室小鼠的饲养管理&lt;/li&gt;&lt;li&gt;实验室蚊虫的保种与维护&amp;#8211;s&lt;/li&gt;&lt;李&gt;吉姆萨染色薄血涂片的显微镜检查&lt;/li&gt;&lt;li&gt;红细胞密度的测定&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;实验室小鼠的饲养与管理&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;使用5至8周龄的近交系实验室小鼠BALB/c雌性个体进行研究。小鼠饲养在标准的实底聚碳酸酯笼具中，笼顶为金属网盖，配备饲料盒和饮水瓶。小鼠维持在恒定温度（25 &amp;#177; 1&amp;#x00B0;C）在12小时光照：12小时黑暗循环条件下饲养。小鼠可自由摄食2018S Harlan Teklad Global 19%蛋白挤压颗粒啮齿类动物饲料（可高温灭菌，购自Harlan-Teklad），并自由饮用酸化饮用水。动物实验均依照美国国立过敏与传染病研究所动物护理与使用委员会在LMVR11E号方案（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）下制定的指南与规定进行。&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;实验室蚊虫的保种与维护&amp;#8211;s&lt;/p&gt;&lt;p 类=&quot;jove_content&quot;&gt;蚊子&amp;#8211;来自实验室培育的斯氏按蚊（Anopheles stephensi）种群。成虫饲养于尼龙网笼中，置于温度和湿度受控的房间内（23至25）&amp;#x00B0;C 为 &lt;em&gt;疟原虫 y&amp;#8211;五十二&lt;/em&gt; 和 &lt;em&gt;疟原虫卡氏亚种&lt;/em&gt;，以及19到21&amp;#x00B0;C 代表 &lt;em&gt;疟原虫伯氏株&lt;/em&gt;；80%至95%湿度；12小时光照：12小时黑暗循环）。成蚊&amp;#8211;幼虫以含10%葡萄糖和2.00%对氨基苯甲酸（PABA）的水溶液饲喂。为获得高质量的成虫，将500条幼虫在1 L蒸馏水中低密度培养于1,000 cm²的容器中。&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; 敞口培养皿中加入约1 mg碳酸氢钠。孵化后，幼虫喂食tetramin粉末（PETCO），直至发育至蛹期，随后转移至成蚊饲养笼中羽化。&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;吉姆萨染色薄血涂片的显微镜检查&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;使用干净的剪刀剪下感染小鼠的尾尖（1.0 mm）&amp;rsquo;s 尾部。放置一滴（0.5–1.0） &amp;#x03BC;将尾部血液约 L 滴于干净的载玻片上。小鼠出血将在 1–2 分钟内停止。取一片干净的推片置于血滴上方，保持 45° 角&amp;#x00B0; 相对于载玻片成一定角度，使血液吸附至推片的整个宽度。手持载玻片，迅速而平稳地向前推动推片，形成薄血膜。待血膜自然干燥后，将玻片浸入无水甲醇中固定。再次空气干燥后，滴加吉姆萨染液（10%吉姆萨染料溶于蒸馏水）覆盖血膜。室温下染色10–15分钟，随后用自来水小心冲洗玻片，并再次空气干燥。使用光学显微镜在油镜下（100倍物镜，总放大倍数1000倍）观察感染红细胞（iRBC；感染红细胞形态见图3）的数量，并计算寄生虫血症率（每计数100个红细胞中的iRBC数量）。不同疟原虫株系的生长速率和致病性存在差异。注射后24小时可开始监测红细胞期寄生虫血症水平，具体时间取决于接种的红细胞期疟原虫剂量。例如，当注射剂量为10时，小鼠在24小时后即可检出显微镜下阳性结果&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; 感染的红细胞腹腔注射或10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 受感染的红细胞静脉注射。&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;红细胞密度的测定&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;与寄生血症水平类似，感染小鼠的红细胞（RBC）密度在感染过程中会不断变化。应在单克隆和混合克隆感染实验以及克隆实验开始前1-2小时内测定RBC密度。测定RBC密度有两种方法：使用Neubauer血细胞计数板进行手工计数，或使用Cellometer（Nexcelom Bioscience）进行自动计数。两种方法均需采集1 &amp;#x03BC;用玻璃毛细管（VWR）采集小鼠尾部血液 10 L，加入 10 mL PBS 中稀释，充分混匀。使用血细胞计数板（Neubauer）时，加载 20 &amp;#x03BC;将悬浮液的L滴加到血细胞计数板上。将血细胞计数板置于配备10倍物镜的光学显微镜下。血细胞计数板包含一个分为9个大方格的网格，其中四个角的大方格各自进一步分为16个小方格。计数四个角的每个大方格中16个小方格内的细胞总数。为避免计数偏差或重复计数跨越网格线的细胞，当细胞与网格线重叠时，仅计数与上边界和左边界相接的细胞 &quot;在&quot; 如果它与上方或右侧的线条重叠 &quot;出&quot; 如果细胞与下方或左侧的线重叠，则不计入。估算一个中方格内四个小方格的细胞总数，再除以0.00625（每个小方格的体积为6.25 nL），即可得到每微升（μL）的细胞数量。&amp;#x03BC;L）。根据此数据，乘以10,000（稀释倍数），计算最终红细胞密度。用蒸馏水和70%乙醇清洗盖玻片和计数室，自然晾干。或者，加入20 &amp;#x03BC;将悬浮液的L量移至Cellometer计数板载玻片上。将载玻片插入Cellometer滑片室（读数仪）中。启动Cellometer软件，选择相应的程序 &quot;红细胞&quot; 选项，并输入10,000的稀释倍数。记录红细胞密度。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

啮齿类疟原虫遗传杂交实验方案

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

疟原虫对疟疾药物的反应差异及其致病性差异具有重要的生物学和医学意义。连锁图谱分析已成功鉴定了导致鼠类1-3和人类4-6疟原虫多种性状的基因或基因座。疟原虫约氏疟原虫（Plasmodium yoelii）是自非洲野生啮齿类动物中分离出的多种疟原虫之一，现已适应在实验室条件下生长。该物种再现了人类疟原虫的许多生物学特征；同时，研究人员也已为该寄生虫开发了微卫星和扩增片段长度多态性（AFLP）等遗传标记7-9。因此，可开展鼠疟原虫的遗传学研究，以补充对恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）的研究。本文中，我们演示了约氏疟原虫（P. yoelii）遗传杂交技术的操作方法，该技术最初由爱丁堡大学的大卫·瓦利克（David Walliker）、理查德·卡特（Richard Carter）及其同事率先建立10。

在P. yoelii及其他啮齿类疟原虫中进行遗传杂交，需将含有两种基因型不同且表型存在差异的克隆配子体的接种物感染小鼠Mus musculus，并在感染后第4天让蚊子吸食感染小鼠的血液。在蚊子吸血前，需通过显微镜确认小鼠血液中存在雄性和雌性配子体。吸血后48小时内，在蚊子中肠内，单倍体配子体分化为雄性和雌性配子，完成受精并形成二倍体合子（图1）。在合子发育为动合子的过程中，似乎会发生减数分裂11。若合子是由两种基因型不同的寄生虫配子通过异体受精形成，则可能发生遗传物质交换（即同源染色体间非姐妹染色单体的染色体重新分配和交叉互换；图2），导致同源位点上的遗传重组。每个合子经历连续两次核分裂，产生四个单倍体核。动合子进一步发育为卵囊。卵囊成熟后，会生成数千个子孢子（杂交后代），并释放至蚊体血腔中。从蚊子唾液腺中收集子孢子，并将其注射入新的小鼠宿主体内，使其进行红细胞前和红细胞内的发育。在进行遗传连锁图谱分析之前，需对红细胞内的寄生虫形态进行克隆和分类，以区分亲本株系的特征。亲本克隆的单独对照感染操作与遗传杂交的制备过程相同。

通过将两种基因型不同的寄生虫喂给蚊子，可实现啮齿类疟原虫的遗传杂交。在允许蚊子叮咬感染小鼠后，从小鼠血液中分离并克隆重组子代。本视频展示了如何对Plasmodium yoelii进行遗传杂交，该方法也适用于其他啮齿类疟原虫。

对抗疟药物反应及疟原虫致病性的差异具有重要的生物学与医学意义。连锁作图已导致……

本实验的总体目标是通过遗传杂交方法，对啮齿类疟原虫约氏疟原虫（plasmodium yoi）进行交配，以获得重组子代。该过程首先将含有两种待杂交亲本克隆的混合接种物注射到一组小鼠体内。随后，利用感染的小鼠喂饲蚊子，使两种亲本株的配子在蚊体内融合形成二倍体合子；在此阶段发生的减数分裂可导致基因重组，从而产生重组子代。随后从蚊子的唾液腺中收集获得的子孢子，并重新注射到未经免疫的受体小鼠体内，以获取血液期寄生虫，其中包含可通过有限稀释法分离的单个重组克隆。在一次成功的实验中，5%至10%的克隆系将为重组体，可通过针对合适的遗传标记进行基因分型加以鉴定。该方法有助于回答疟疾研究领域中的关键问题，例如：疟疾寄生虫耐药性和传播能力的遗传决定因素是什么？寄生虫：在室温下放置两支含有冷冻血液阶段的疟原虫样本，用于进行杂交。本示例中使用的两种鼠疟原虫菌株为约氏疟原虫（Plasmodium yoelii）和尼日利亚约氏疟原虫（Plasmodium yoelii nigeriensis）。使用一支装有22至30号针头的注射器，并用同一注射器吸取400 µL pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）。吸取100微升含Thor病毒的血液，将注射器上下颠倒，直至内容物均匀混合。在本实验演示过程中，将使用麻醉动物以最大程度减少疼痛和应激反应。麻醉方法为向小鼠腹腔注射50微升麻醉剂混合液，其中包含每千克体重82.5毫克的氯胺酮和每千克体重7.5毫克的赛拉嗪。监测小鼠的麻醉深度，以防止死亡。采用此方法，小鼠将保持麻醉状态20至30分钟。在苏醒前，向小鼠腹腔直接注射200 µL含寄生虫的溶液。操作完成后，将注射器丢弃至锐器盒中。采用此方法，用两种待杂交的寄生虫分别感染两只小鼠，注射后3至5天进行传代。感染小鼠体内将发育出血液期寄生虫。使用无菌剪刀剪取感染不同寄生虫品系的供体小鼠尾尖。在载玻片上收集一滴小鼠尾部血液，并制备薄血涂片。用吉姆萨染液对薄血涂片进行染色。由于未感染的细胞缺乏细胞核，Guillem SA 染料不会对未感染的红细胞进行染色。SAI 会染色感染红细胞内寄生虫的细胞核，此时红细胞中的寄生虫呈现环状阶段、滋养体、裂殖体及正在破裂的裂殖子形态。当两种小鼠体内的寄生虫贫血率达到1%至5%时，即可收获血液阶段的寄生虫用于混合克隆感染。剪取感染不同寄生虫的供体小鼠的尾尖。使用无菌剪刀按前述方法进行操作。用玻璃毛细管采集1 µL小鼠尾部血液，加入1 mL无菌PBS中。取20 µL血液悬液，用细胞计分析红细胞密度。根据红细胞密度和疟原虫感染率参数，将血液样本用生理柠檬酸盐盐溶液稀释，使感染红细胞的浓度达到每100微升含100万个。取自两位供体的感染血液样本按1:1比例混合，制备成混合克隆接种液。随后，向每只待感染小鼠腹腔注射100微升该混合样本。使用两只小鼠进行单克隆感染，以确认每个亲本株成功传播。感染后约四天，寄生虫的有性阶段（即雄性和雌性配子体）应开始在小鼠血液中出现。从该时间点开始，每日采集尾部血液，按前述方法制备持续性薄血涂片，监测配子体的出现情况。由于存在较大的颗粒或色素，可以识别出雄性和雌性细胞。雄性gato细胞的细胞质呈粉红色，而雌性TER细胞的细胞质呈蓝色。只有成熟的gato细胞才具有一个大的液泡。一旦检测到成熟雌雄配子体，即可使用这些小鼠喂饲蚊虫。向每只感染小鼠的腹腔注射 50 微升的氯胺酮、赛拉嗪麻醉溶液。待小鼠麻醉后，将其腹部朝下放置于一个装有 50 至 100 只雌性按蚊（Anis defense enzyme mosquitoes）的笼子上方，这些蚊虫已禁糖 24 小时，允许蚊虫 uninterrupted 地吸血 30 分钟。在喂食期结束后立即人道处死小鼠。如果传播成功，在喂食后的第九天，蚊子摄入的配子体将融合形成二倍体合子，进而发育为卵囊，可在昆虫的中肠内观察到。检测到的卵囊越多，表明成功生成重组寄生虫的可能性越高。使用吸虫器从笼中收集5至10只感染的蚊子，并将蚊子转移到一个小容器中。用二氧化碳气体麻醉蚊子，然后将其转移到置于冰上的玻璃培养皿中。触角明显比雌蚊浓密的雄蚊应予以弃去。用 PBS 填充两支注射器，并安装26号半英寸针头。从一支注射器中向载玻片滴加约100微升 PBS。将5至10只麻醉的雌蚊转移至 PBS 液滴中，并使用针头将载玻片放置于解剖显微镜下。去除每只蚊子的翅膀和足，然后一手握住昆虫的胸部，另一手握住腹部后端，将虫体拉开，直至中肠（呈白色囊状结构）被释放出来。在解剖过程中，分离中肠并丢弃其余虫体部分。使用解剖针中的 PBS 确保中肠保持湿润。解剖完成后，在中肠上放置盖玻片。在光学显微镜下以 100 倍放大倍数观察中肠。OOS 将表现为位于中肠外表面的厚壁环状结构。计数每个中肠中的 OOS 数量。喂食后 17 天，由 sys 释放的子孢子应已迁移至蚊子的唾液腺，即疟原虫的子孢子。一种细长的纺锤形细胞，用于收获子孢子。首先，使用干净的剪刀准备一个收集管。剪掉一个小型500 µL离心管的管盖。将无菌 19 号针头的尖端加热，并刺穿管底。用玻璃棉填充管体积的三分之一以制成过滤器。将此过滤管插入一个较大的 1.5 毫升离心管中。滤器装置准备好后，按照之前所述方法收集并麻醉蚊子。如前所述将昆虫进行空气固定以进行解剖，移除蚊子的头部、翅膀、腿部和腹部，仅保留含有感染的唾液腺的胸部。使用尖头镊子将胸部组织转移至含有 500 微升 PBS 的 1.5 毫升匀浆器中。在冰上匀浆胸部组织，以从唾液腺中释放子孢子，然后用玻璃移液器将匀浆液转移至过滤装置中。将滤管在 1000 转/分钟的条件下离心 10 至 20 秒。离心完成后，使用装有22至30号针头的注射器收集滤过液。将100至500微升的子孢子悬液注入小鼠腹腔内。感染后第三天开始监测小鼠的寄生虫血症水平及红细胞密度。选择一只表现出0.1%至1%寄生率且感染红细胞中主要为单个寄生虫的小鼠作为克隆实验的供体。用PBS稀释小鼠尾部血液，在冰上将其与等体积的小牛血清和哺乳动物林格氏液混合，调整至每100 µL含有0.6至1个感染红细胞的浓度，并将接种物置于冰上保存。用乙醇清洁尾部注射部位，进行静脉注射。向每只小鼠注射100微升稀释的感染血液，共注射100只小鼠。通过这种方式，每只小鼠应接受一个或零个寄生虫。在成功的实验中，20%至50%的小鼠在第8天时寄生率应达到0.1%至0.5%。接种后五到七天，通过检查吉姆萨染色的薄血涂片来筛查小鼠血液中是否存在裂殖体阶段的寄生虫。随后可利用位于不同染色体上的遗传标记（如微卫星标记和单核苷酸多态性），对来自杂交后代的寄生虫通过PCR方法进行基因分型，DNA样本来源于尾部血液。若寄生虫的各个独立遗传位点分别来源于两个亲本克隆，则为重组克隆。感染重组寄生虫的动物血液可冷冻保存以供将来使用。在成功的实验中，总共约有5%至10%的小鼠会产生独立的重组子代。观看本视频后，您应能够充分理解如何在疟疾中实现遗传操作过程。寄生虫加培养基 yoi。该方法同样适用于其他种类的寄生虫。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

生产的灭鼠疟疾寄生虫的遗传交叉议定书“

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一旦某个基因被鉴定为可能具有抗疟疾特性，就必须评估其在蚊子体内抑制疟原虫感染的作用。本方案展示了如何检测疟原虫在蚊子体内的感染程度。文中演示了配子体培养的制备、通过膜饲法使蚊子吸食含人类血液的样本，以及检测蚊子中肠内病毒滴度的技术。...

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本视频展示了脑型疟疾小鼠实验模型的建立。从感染疟原虫的按蚊中分离出的子孢子被用于感染小鼠，以模拟人类脑型疟疾的病理过程。 疟原虫伯氏疟原虫将感染的雌性蚊子注入被固定的实验小鼠尾静脉，可导致血脑屏障破坏和脑部炎症，从而引发脑型疟疾。该感染小鼠模型为研究脑型疟疾提供了重要的工具 体内...

利用宿主蚊媒来源的子孢子建立小鼠实验性脑型疟疾模型

结核病和疟疾是人类中最常见的两种感染性疾病，也是热带地区贫困人群中发病和死亡的主要原因。我们建立了一个实验模型系统，用于研究小鼠经自然感染途径同时感染疟原虫和结核分枝杆菌后，疟疾-结核共感染的结果。...

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传播疟疾的蚊子具有一些重要的流行病学特征，这些特征只能通过分子技术进行检测。我们利用基于 MALDI-TOF 的 SNP...

一种用于检测传播疟疾蚊虫的多指标检测方法

由于啮齿类疟原虫在生命周期和生物学特性上与人类疟原虫具有显著相似性，啮齿类疟疾模型已成为疟疾研究不可或缺的工具。本文中，我们对野生型和转基因啮齿类疟原虫进行表型分析时所使用的一些最重要技术进行了标准化。...

啮齿类疟原虫无性与有性血液阶段及蚊期阶段的表型分析

我们描述了一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在Plasmodium...

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建人类疟原虫P. falciparum的条件性突变体

双组分GAL4-UAS系统是一种多功能工具，可用于在可控的时空条件下调控基因表达，从而在Anopheles...

利用GAL4-UAS系统在Anopheles gambiae中进行功能遗传学研究

该方案描述了如何在基因组中实现定点修饰 按蚊属 疟疾蚊子使用 φC31 系统。所描述的修饰包括基因组中转基因盒的整合与置换...

定点 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

疟疾通过子孢子阶段的接种传播 疟原虫 通过感染的蚊子传播。转基因 疟原虫 使我们能够更深入地理解疟疾的生物学特性，并直接推动了疟疾疫苗的研发工作。在此，我们描述了一种简化的转基因制备方法 疟原虫伯氏疟原虫...

生成基因修饰的Plasmodium berghei子孢子

化学遗传学涉及在靶位点处将看门残基替换为含有不同侧链的氨基酸。在此，我们构建了一种含有cdpk1功能低下等位基因的突变寄生虫，并鉴定了该突变背景下寄生虫所采用的补偿性通路。...

理解携带植物样激酶功能低下等位基因的突变疟原虫中补偿通路的发育

学习利用Plasmodium yoelii进行鼠疟原虫遗传杂交的方法，通过蚊媒传播和孢子虫分离获得重组后代。该技术有助于研究疟疾耐药性及传播性的遗传决定因素，为寄生虫学研究提供重要工具。

啮齿类疟原虫遗传杂交实验方案

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