啮齿类疟原虫遗传杂交实验方案

本实验的总体目标是通过遗传杂交方法，对啮齿类疟原虫约氏疟原虫（plasmodium yoi）进行交配，以获得重组子代。该过程首先将含有两种待杂交亲本克隆的混合接种物注射到一组小鼠体内。随后，利用感染的小鼠喂饲蚊子，使两种亲本株的配子在蚊体内融合形成二倍体合子；在此阶段发生的减数分裂可导致基因重组，从而产生重组子代。

随后从蚊子的唾液腺中收集获得的子孢子，并重新注射到未经免疫的受体小鼠体内，以获取血液期寄生虫，其中包含可通过有限稀释法分离的单个重组克隆。在一次成功的实验中，5%至10%的克隆系将为重组体，可通过针对合适的遗传标记进行基因分型加以鉴定。该方法有助于回答疟疾研究领域中的关键问题，例如：疟疾寄生虫耐药性和传播能力的遗传决定因素是什么？

寄生虫：在室温下放置两支含有冷冻血液阶段的疟原虫样本，用于进行杂交。本示例中使用的两种鼠疟原虫菌株为约氏疟原虫（Plasmodium yoelii）和尼日利亚约氏疟原虫（Plasmodium yoelii nigeriensis）。使用一支装有22至30号针头的注射器，并用同一注射器吸取400 µL pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）。

吸取100微升含Thor病毒的血液，将注射器上下颠倒，直至内容物均匀混合。在本实验演示过程中，将使用麻醉动物以最大程度减少疼痛和应激反应。麻醉方法为向小鼠腹腔注射50微升麻醉剂混合液，其中包含每千克体重82.5毫克的氯胺酮和每千克体重7.5毫克的赛拉嗪。

监测小鼠的麻醉深度，以防止死亡。采用此方法，小鼠将保持麻醉状态20至30分钟。在苏醒前，向小鼠腹腔直接注射200 µL含寄生虫的溶液。

操作完成后，将注射器丢弃至锐器盒中。采用此方法，用两种待杂交的寄生虫分别感染两只小鼠，注射后3至5天进行传代。感染小鼠体内将发育出血液期寄生虫。

使用无菌剪刀剪取感染不同寄生虫品系的供体小鼠尾尖。在载玻片上收集一滴小鼠尾部血液，并制备薄血涂片。用吉姆萨染液对薄血涂片进行染色。

由于未感染的细胞缺乏细胞核，Guillem SA 染料不会对未感染的红细胞进行染色。SAI 会染色感染红细胞内寄生虫的细胞核，此时红细胞中的寄生虫呈现环状阶段、滋养体、裂殖体及正在破裂的裂殖子形态。当两种小鼠体内的寄生虫贫血率达到1%至5%时，即可收获血液阶段的寄生虫用于混合克隆感染。

剪取感染不同寄生虫的供体小鼠的尾尖。使用无菌剪刀按前述方法进行操作。用玻璃毛细管采集1 µL小鼠尾部血液，加入1 mL无菌PBS中。取20 µL血液悬液，用细胞计分析红细胞密度。

根据红细胞密度和疟原虫感染率参数，将血液样本用生理柠檬酸盐盐溶液稀释，使感染红细胞的浓度达到每100微升含100万个。取自两位供体的感染血液样本按1:1比例混合，制备成混合克隆接种液。随后，向每只待感染小鼠腹腔注射100微升该混合样本。

使用两只小鼠进行单克隆感染，以确认每个亲本株成功传播。感染后约四天，寄生虫的有性阶段（即雄性和雌性配子体）应开始在小鼠血液中出现。从该时间点开始，每日采集尾部血液，按前述方法制备持续性薄血涂片，监测配子体的出现情况。

由于存在较大的颗粒或色素，可以识别出雄性和雌性细胞。雄性gato细胞的细胞质呈粉红色，而雌性TER细胞的细胞质呈蓝色。只有成熟的gato细胞才具有一个大的液泡。

一旦检测到成熟雌雄配子体，即可使用这些小鼠喂饲蚊虫。向每只感染小鼠的腹腔注射 50 微升的氯胺酮、赛拉嗪麻醉溶液。待小鼠麻醉后，将其腹部朝下放置于一个装有 50 至 100 只雌性按蚊（Anis defense enzyme mosquitoes）的笼子上方，这些蚊虫已禁糖 24 小时，允许蚊虫 uninterrupted 地吸血 30 分钟。

在喂食期结束后立即人道处死小鼠。如果传播成功，在喂食后的第九天，蚊子摄入的配子体将融合形成二倍体合子，进而发育为卵囊，可在昆虫的中肠内观察到。检测到的卵囊越多，表明成功生成重组寄生虫的可能性越高。

使用吸虫器从笼中收集5至10只感染的蚊子，并将蚊子转移到一个小容器中。用二氧化碳气体麻醉蚊子，然后将其转移到置于冰上的玻璃培养皿中。触角明显比雌蚊浓密的雄蚊应予以弃去。

用 PBS 填充两支注射器，并安装26号半英寸针头。从一支注射器中向载玻片滴加约100微升 PBS。将5至10只麻醉的雌蚊转移至 PBS 液滴中，并使用针头将载玻片放置于解剖显微镜下。

去除每只蚊子的翅膀和足，然后一手握住昆虫的胸部，另一手握住腹部后端，将虫体拉开，直至中肠（呈白色囊状结构）被释放出来。在解剖过程中，分离中肠并丢弃其余虫体部分。

使用解剖针中的 PBS 确保中肠保持湿润。解剖完成后，在中肠上放置盖玻片。在光学显微镜下以 100 倍放大倍数观察中肠。

OOS 将表现为位于中肠外表面的厚壁环状结构。计数每个中肠中的 OOS 数量。喂食后 17 天，由 sys 释放的子孢子应已迁移至蚊子的唾液腺，即疟原虫的子孢子。

一种细长的纺锤形细胞，用于收获子孢子。首先，使用干净的剪刀准备一个收集管。剪掉一个小型500 µL离心管的管盖。

将无菌 19 号针头的尖端加热，并刺穿管底。用玻璃棉填充管体积的三分之一以制成过滤器。将此过滤管插入一个较大的 1.5 毫升离心管中。

滤器装置准备好后，按照之前所述方法收集并麻醉蚊子。如前所述将昆虫进行空气固定以进行解剖，移除蚊子的头部、翅膀、腿部和腹部，仅保留含有感染的唾液腺的胸部。

使用尖头镊子将胸部组织转移至含有 500 微升 PBS 的 1.5 毫升匀浆器中。在冰上匀浆胸部组织，以从唾液腺中释放子孢子，然后用玻璃移液器将匀浆液转移至过滤装置中。将滤管在 1000 转/分钟的条件下离心 10 至 20 秒。

离心完成后，使用装有22至30号针头的注射器收集滤过液。将100至500微升的子孢子悬液注入小鼠腹腔内。感染后第三天开始监测小鼠的寄生虫血症水平及红细胞密度。

选择一只表现出0.1%至1%寄生率且感染红细胞中主要为单个寄生虫的小鼠作为克隆实验的供体。用PBS稀释小鼠尾部血液，在冰上将其与等体积的小牛血清和哺乳动物林格氏液混合，调整至每100 µL含有0.6至1个感染红细胞的浓度，并将接种物置于冰上保存。用乙醇清洁尾部注射部位，进行静脉注射。

向每只小鼠注射100微升稀释的感染血液，共注射100只小鼠。通过这种方式，每只小鼠应接受一个或零个寄生虫。在成功的实验中，20%至50%的小鼠在第8天时寄生率应达到0.1%至0.5%。

接种后五到七天，通过检查吉姆萨染色的薄血涂片来筛查小鼠血液中是否存在裂殖体阶段的寄生虫。随后可利用位于不同染色体上的遗传标记（如微卫星标记和单核苷酸多态性），对来自杂交后代的寄生虫通过PCR方法进行基因分型，DNA样本来源于尾部血液。若寄生虫的各个独立遗传位点分别来源于两个亲本克隆，则为重组克隆。

感染重组寄生虫的动物血液可冷冻保存以供将来使用。在成功的实验中，总共约有5%至10%的小鼠会产生独立的重组子代。观看本视频后，您应能够充分理解如何在疟疾中实现遗传操作过程。

寄生虫加培养基 yoi。该方法同样适用于其他种类的寄生虫。