一种用于记录遗传标记视网膜神经节细胞光反应的离体视网膜制备方法

本实验的总体目标是从分离的小鼠视网膜中记录遗传标记的视网膜神经节细胞的光诱发反应。首先从小鼠眼球中分离出视网膜，完成第一步。实验的第二步是用酶处理视网膜，以去除残留的玻璃体。

该实验步骤的第三步是将视网膜神经节细胞层朝上固定于记录室中，将记录室安装至显微镜载物台上，并识别基因标记的神经节细胞。实验的最后一步是对已识别的神经节细胞进行全细胞记录，并记录光刺激诱发的反应。最终，可通过单细胞膜片钳记录获得特定类型小鼠视网膜神经节细胞的功能特性结果，并明确其向大脑传递的信号特征。

您好，我叫Tiffany Schmidt，是明尼苏达大学Paulo Ka Fuji博士实验室的一名神经科学专业的研究生。该技术可实现对特定基因标记的视网膜神经节细胞群体进行识别和记录，并进一步开展形态学分析。该技术有助于解答视觉领域中的关键问题，例如不同亚型的神经节细胞如何处理视觉刺激的关键特征。在实施手术之前。

为了去除视网膜，首先需要配制实验所需的八种溶液。本实验所用所有溶液的成分均在随附文本中列出。将200毫升细胞外溶液转移至250毫升烧杯中，用于视网膜储存。

将剩余的细胞外溶液放入分液漏斗中，用于记录期间的重力灌流。这两种溶液应始终维持在95%氧气和5%二氧化碳饱和的环境中。为了在实验过程中观察树突结构，可在细胞内溶液中加入荧光示踪剂，例如LOR 5 94。

如果计划在全细胞记录后进行免疫组织化学实验，请在细胞内液中加入0.3%神经生物素。待所需溶液配制完毕后，采用二氧化碳窒息法处死小鼠，用弯头2号镊子轻轻从眼球后方插入并提起，摘除眼球。使用眼科剪清除眼外肌，并剪断视神经。

将眼球置于盛有细胞外液的35毫米培养皿中。使用眼科剪剪除角膜，并用5号镊子取出晶状体。用5号镊子撕开巩膜，并在视网膜与巩膜交界处剪断剩余的视神经。

用镊子在视网膜与巩膜之间的间隙中轻轻操作，将视网膜从眼杯上剥离。为节省时间，每个步骤应先在两只眼的视网膜上均完成后再进入下一步。一个关键步骤是去除附着在视网膜上的玻璃体。首先用镊子夹住视网膜上方透明的玻璃体开始操作。

如果成功移除了玻璃体，你会在镊子尖端看到一小块透明的凝胶状物质。将每片视网膜切成两半，以最大化可利用组织的数量，并便于将视网膜安装到记录室中。将视网膜置于室温的充氧细胞外溶液中，并通过仅保留最低限度的环境光（如计算机屏幕发出的光）来减少光照暴露，视网膜在此条件下可保持活性约六小时。

解剖后，从视网膜外组织所处的细胞外溶液中取出 500 微升。将一份胶原酶-透明质酸酶酶溶液加入其中并稀释。

将酶溶液放入35毫米的培养皿中，并将其中一个已解剖的视网膜转移至该培养皿内。持续轻轻灌流95%氧气和5%二氧化碳混合气体，同时旋转培养皿15分钟。酶溶液可去除残留的玻璃体，从而更便于接近节细胞层。对于来自较年轻动物、玻璃体较少的视网膜，或若观察到不良反应时，消化时间可缩短至5分钟。

使用剪去尖端的塑料移液管，将视网膜从含有酶的培养基中取出，并在细胞外溶液中充分洗涤视网膜。

将视网膜转移至记录室中。使感光细胞层朝下，用移液器或滤纸吸去残留液体，并轻轻展开视网膜边缘，使组织展平。操作时需小心，仅接触视网膜边缘，避免触碰节细胞层。

为了固定视网膜，将带有尼龙网的铂金环置于视网膜上方，然后立即用细胞外液填充记录室。将记录室安装在显微镜载物台上，随后连接用于重力灌注细胞外液的导管、真空吸引管和接地线。调节重力流速，使其滴速达到每分钟1 mL或更快。

如果灌流速度过慢，组织将无法得到充分的氧气供应，突触信号传递可能因此受到干扰。下一步是设置全细胞膜片钳记录用的电极。选择电阻在3至5兆欧范围内的移液管。

使用解冻的细胞内液 aliquot 填充记录电极，在10倍物镜下利用红外照明和微分干涉差（DIC）光学系统将电极插入电极夹持器中。观察视网膜和记录电极。使用红外光可最大限度减少视网膜对可见光的暴露，从而减少光适应；随后切换至40倍物镜，将电极移至组织上方并进入视野。

本研究中使用的小鼠品系在其视网膜神经节细胞中表达EGFP，因此可通过落射荧光显微镜观察到神经节细胞。显微镜以480纳米的落射荧光照射视网膜。若视网膜健康，单个神经节细胞应清晰可见。

不健康的视网膜会具有较大的颗粒状细胞核，应予以弃用。选择其中一个荧光标记的神经节细胞用于记录，并使用实验室胶带在计算机显示器上标记所选细胞。切换至红外光学模式，以便观察到所选神经节细胞的胞体。

将记录电极置于目标神经节细胞附近。通过向记录电极施加轻微的正压，清洁覆盖细胞的区域。电极压力通过连接在放大器零点的聚乙烯管与12 ml塑料注射器相连的移液管 holder 施加。

任何电压偏移。将电极放置在选定的神经节细胞上，直至细胞表面出现凹陷。将放大器置于电压钳模式，施加测试脉冲，并监测通过移液管的电流。

施加负压，使电极与细胞之间形成封接。当封接开始形成时，释放负压，并等待钳制电流显示细胞膜与玻璃微电极之间已形成吉欧级电密封。随后施加轻微的负压脉冲，直至出现电容瞬变信号，表明已进入全细胞记录模式，此时应完全释放所施加的压力。

如果接入电阻大于30兆欧，通常可通过施加额外的极轻微负压脉冲来改善。获得全细胞模式后，关闭红外光源，并用黑色布料遮盖显微镜。让细胞在暗处适应五分钟。

五分钟后，样品即可进行记录。在电流钳模式下，开启全视野白光刺激，并记录神经节细胞的反应。若需对神经节细胞进行多次刺激，每次刺激之间应根据需要使视网膜充分暗适应。

此时还可以调整光刺激，加入有特定图案或颜色的刺激，以在记录后评估神经节细胞的反应特性。通过在落射荧光与微分干涉差（DIC）红外光学模式之间切换，细胞内溶液中的荧光示踪剂已扩散至树突。可在594纳米波长的落射荧光下观察示踪剂，并检查树突形态，以确定该神经节细胞属于“开-关”型或分层类型。先前加入细胞内溶液的神经生物素（neuro biotin）也已扩散进入神经节细胞，因此下一步是为视网膜进行免疫组织化学处理做准备。

轻柔地回撤移液管，以尽量减少对细胞膜的扰动。请注意，如果每个制备样本仅记录并填充一个视网膜神经节细胞，则可将所记录的神经节细胞与其详细形态进行特异性关联。接下来，将视网膜置于多聚甲醛溶液中，并在4 °C下固定过夜。

用 PBS 清洗固定的视网膜，历时两小时或更长时间，期间至少更换六次 PBS 溶液。清洗后，将视网膜转移至含有封闭液的培养皿中，将培养皿置于摇床上，室温下静置两小时。随后，在室温下用链霉亲和素检测试剂替换封闭液，将视网膜重新放回摇床，于 4°C 孵育两天。

两天后，用 PBS 冲洗视网膜，每次 20 分钟，共冲洗六次，以进行视网膜铺片。将视网膜神经节细胞层朝上置于载玻片上，使用抗荧光淬灭封片剂（Vector Shield）。用盖玻片覆盖封片介质，轻轻滑动并用指甲油封边，标记的神经节细胞现在可在共聚焦显微镜下观察。

该图显示了在左侧40倍放大下通过落射荧光照明观察到的GFP阳性视网膜神经节细胞，以及在右侧通过微分干涉差（DIC）照明观察到的细胞。如果视网膜健康且解剖操作成功，在高倍DIC下可清晰看到单个神经节细胞。不健康的视网膜会呈现大而颗粒状的细胞核，应予以弃用。

该图展示了一种典型的M2型向上分层的内在光敏性视网膜神经节细胞的光反应类型。根据特定制备样本中基因标记的视网膜神经节细胞类型不同，其反应特性也会有所差异。如果某个神经节细胞的突触反应保持完整，则该细胞应在光照开始或终止时产生动作电位。

对于一种内在光敏性神经节细胞而言，会出现持续性去极化。这幅显示经神经生物素标记的神经节细胞的图像，展示了一个典型的M1型离层分布的内在光敏性视网膜神经节细胞的形态。在进行全细胞记录后，通过免疫组织化学染色，可将树突形态与视网膜神经节细胞的电生理反应进行关联分析。在实施该操作过程中，必须注意对视网膜灌流腔持续供氧，并迅速灌注组织，以保持突触反应的完整性。

感谢观看本次演示。