Name: 一个孤立的视网膜制备，记录从基因标记的视网膜神经节细胞的光反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 学习使用全细胞膜片钳技术记录小鼠离体视网膜中基因标记神经节细胞的光诱发反应，并结合形态学分析揭示其功能特性。该方法为视觉神经科学研究提供了重要工具。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 R01EY012949、R21EY018885、T32 EY0707133。我们感谢 Darwin Hang 提供的技术支持。

动物使用声明： 动物的饲养和管理遵循所述指南中的规定 实验动物护理和使用的指南，采用明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会批准的方案。
1）溶液的配制
<ol>
 <li> 在进行电生理记录之前，需要配制细胞内液、细胞外液和酶溶液。</li>
 <li> 细胞外液：将一瓶（8.8 g）粉末状Ames培养基（Sigma）与1 L H2O和1.9 g碳酸氢钠（23 mM）混合。在整个操作过程中，细胞外液需持续用95% O2/5% CO2混合气体饱和。取200 mL转移至烧杯中用于视网膜保存。剩余溶液置于灌流系统的容器中，待视网膜安装后用于重力灌流。</li>
 <li> 细胞内液：细胞内液应预先配制，并分装为500–1000 μL的等分试样，于-20 °C保存。细胞内液的配方根据实验需求有所不同；本实验中用于电流钳记录的配方（单位为mM）如下：125 K-葡萄糖酸盐、2 CaCl2、2 MgCl2、10 EGTA、10 HEPES、2 Na2-ATP、0.5 NaGTP，用KOH调节pH至7.25。可加入10 μM Alexafluor-594 肼（Invitrogen）等荧光示踪剂以在实验过程中观察树突形态，也可加入0.3%神经生物素（neurobiotin）以便记录后对细胞形态进行分析。准备记录时，将细胞内液解冻。</li>
 <li> 酶溶液：将10000单位胶原酶（Worthington Chemicals）与83 mg透明质酸酶（Worthington Chemicals）溶于4.150 mL细胞外液中。分装为50 μL等分试样，于-20°C保存。分装样品可在数周内使用。处理视网膜前，将一份等分试样稀释于500 μL通入混合气体的细胞外液中。</li>
 <li> 磷酸盐缓冲液（PBS）：在800 mL H2O中加入8 g NaCl、0.2 g KCl、1.4 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，用NaOH调节pH至7.4，最后定容至1 L。</li>
 <li> 0.2 M磷酸盐缓冲液：在800 mL H2O中加入21.8 g Na2HPO4和6.4 g NaH2PO4，加水定容至1 L。</li>
 <li> 4%多聚甲醛溶液：将50 mL H2O加热至60°C，加入4 g多聚甲醛，搅拌数分钟。滴加几滴1 M NaOH（约5滴），持续搅拌至溶液澄清。向烧杯中加入50 mL 0.2 M磷酸盐缓冲液。用pH试纸检测pH值（约为7.4）。过滤并冷却。</li>
 <li> 封闭液（10%山羊血清，0.5% Triton X-100）：在1.8 mL PBS中加入0.2 mL山羊血清和10 μL Triton X-100。Triton X-100用于增加组织通透性。</li>
 <li> 链霉亲和素溶液（5%山羊血清，0.5% Triton X-100，1:500链霉亲和素594）：在1.9 mL PBS中加入0.1 mL山羊血清、10 μL Triton X-100和4 μL链霉亲和素594。</li>
</ol>
2）从小鼠中分离视网膜
所需解剖工具：1 把 #2 镊子、2 把 #5 镊子、眼科剪刀
<ol>
 <li> 根据批准的实验方案处死小鼠，在本实验中采用CO2窒息法，然后用倾斜的#2镊子轻轻插入眼球后方，取出眼球。</li>
 <li> 将眼球置于含有细胞外液的35 mm培养皿中。使用眼科剪刀剪断视神经以及任何附着的眼外肌或结缔组织。用眼科剪剪除角膜，并用#5镊子取出晶状体。用一对#5镊子撕开巩膜，并用镊子在视盘处切断视网膜与巩膜交界处的视神经。轻轻将视网膜从眼杯上剥离。提示：在进行下一步操作前，先对两个视网膜完成同一步骤，以缩短操作时间。</li>
 <li> 使用镊子去除附着在视网膜上的玻璃体。可通过镊子“夹取”视网膜上方透明的玻璃体完成该操作。若成功去除，玻璃体应表现为附着在镊子上的透明凝胶状物质。提示：在去除玻璃体后将视网膜切成两半，可最大化可用组织量，并便于在记录 chamber 中安装。</li>
 <li> 在准备消化前，将视网膜保存于室温、避光且环境光最少的含氧细胞外液中。视网膜以此方式可保存约6小时。</li>
</ol>
3) 用酶混合液处理视网膜并将其安装在记录室中
<ol>
 <li> 将胶原酶/透明质酸酶的等分试样稀释于 500 μL 细胞外溶液，将溶液置于35 mm培养皿中，并转移视网膜。</li>
 <li> 将含有视网膜的培养皿保持覆盖并置于黑暗中，放入95% O2/5% CO₂环境中2 在温和振荡条件下孵育15分钟。此步骤有助于消化残留的玻璃体，并更便于接近节细胞层。提示：对于来自玻璃体较少的年轻动物的视网膜，或观察到不良反应时，孵育时间可缩短至约5分钟。</li>
 <li> 从含酶培养基中取出视网膜，并用细胞外液充分洗涤</li>
 <li> 将视网膜转移至记录室 6 将感光细胞层朝下放置。用移液器或滤纸吸去残留液体，轻轻展开视网膜边缘使其展平，注意仅触碰视网膜边缘，尤其避免接触节细胞层。将带有尼龙网的铂金环置于视网膜上以固定组织，随后立即向记录室中充满细胞外液。</li>
 <li> 将记录室安装到显微镜载物台上，连接重力灌流管和真空吸引管，并连接接地线。</li>
</ol>
4) 表达EGFP的神经节细胞的定位与光刺激
<ol>
 <li> 以重力作用用细胞外液对视网膜进行灌流，流速为1 mL/min或更快。提示：若灌流速度过慢，组织将无法得到充分氧合，可能导致突触信号传递中断。</li>
 <li> 用细胞内液填充记录电极，并将其插入电极夹持器中。提示：电阻在3至5 MΩ范围内的电极可获得最佳结果。</li>
 <li> 在低倍率（10倍物镜，NA 0.3）下使用红外微分干涉差（DIC）光学系统观察视网膜，以定位记录电极。使用红外光可最大限度减少视网膜对可见光的暴露，从而减少光适应。切换至高倍率（40倍物镜，NA 0.8），并将电极移至组织上方视野中。</li>
 <li> 在高倍率（40倍物镜）下，使用落射荧光（EGFP为480 nm）照射视网膜，选择一个荧光标记的节细胞，并在计算机显示器上用胶带标记（图1A）。</li>
 <li> 在DIC和红外照明下，将记录电极移至目标节细胞附近（图1A）。通过连接至电极夹持器的聚乙烯管将12 mL塑料注射器施加轻微正压，清洁覆盖细胞的区域。在放大器上校正任何电压偏移。将电极轻压至选定的节细胞表面，直至细胞表面出现凹陷。</li>
 <li> 将放大器置于电压钳模式，施加测试脉冲并监测流经电极的电流。施加负压以在电极与细胞之间形成封接。当细胞开始封接时释放负压，并等待保持电流稳定，表明细胞膜与电极之间已形成吉欧姆（GΩ）级电学封接。施加轻微的负压脉冲，直至出现电容瞬变，随后释放所有压力。提示：若接入（串联）电阻较高（>30 MΩ），通常可通过额外施加非常轻微的负压脉冲加以改善。</li>
 <li> 一旦形成稳定封接，施加一次负压脉冲。进入全细胞模式后，让细胞在暗环境中适应5分钟。在电流钳模式下记录细胞对全视野白光刺激的反应（图1B）。</li>
 <li> 记录完成后，Alexafluor-594将扩散至树突。可在594 nm落射荧光下观察示踪剂，并通过在落射荧光与DIC红外光学之间切换，判断节细胞为On型、Off型或双层分布型5。</li>
 <li> 若电极内含有神经生物素，且视网膜将用于免疫组织化学处理，则必须缓慢撤回电极，以尽量减少对细胞膜的破坏。</li>
</ol>
5) 记录的神经节细胞解剖学分析
使用神经生物素填充可在记录后对神经节细胞进行更详细的形态学分析。提示：如果需要获得记录的神经节细胞与详细形态之间的特定相关性，最好每次制备仅记录并填充一个视网膜神经节细胞（RGC）。
<ol>
 <li> 如果细胞内液中包含神经生物素（neurobiotin），则将视网膜置于多聚甲醛溶液中，在 4°C 下固定过夜。</li>
 <li> 用 PBS 缓冲液漂洗，至少 2 小时，至少更换 6 次溶液。将视网膜转移至含有封闭液的培养皿中，在室温下于摇床上孵育 2 小时。</li>
 <li> 用链霉亲和素溶液替换封闭液，在 4°C 下于摇床上孵育 2 天。用 PBS 缓冲液漂洗视网膜，共 6 次，每次 20 分钟。</li>
 <li> 用 Vectashield 封片剂将视网膜封片于载玻片上，确保节细胞层朝上。进行共聚焦显微镜观察（图 1C）。</li>
</ol>
代表性结果
如果视网膜健康且解剖操作成功，在高倍微分干涉差（DIC）显微镜下应可见单个的视网膜神经节细胞（图1A）。不健康的视网膜会呈现大而颗粒状的细胞核，应予以弃用。如果某个神经节细胞的突触反应保持完整，则该细胞应在光刺激开始或终止时产生动作电位，而对于内在光敏性神经节细胞（图1B），还会出现持续性去极化反应。
<img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="电生理实验结果；膜电位对光的反应；神经元成像分析。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
 图1. 荧光标记的视网膜神经节细胞的定位、记录与染色。 （A）在40倍放大下，通过落射荧光照明观察到的GFP阳性视网膜神经节细胞（左图）以及在微分干涉差（DIC）照明下的图像（右图）。（B）在荧光标记的视网膜神经节细胞上，采用全细胞电流钳模式记录到的M2型内在光敏性视网膜神经节细胞的突触光反应。（C）M1型内在光敏性视网膜神经节细胞，在落射荧光下识别后，进行全细胞记录，用神经生物素灌注，并随后进行免疫组织化学处理。

<ol><li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
<li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li>
<li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li>
<li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+address+book+for+retinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li>
<li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li>
<li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li>
<li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li>
<li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li>
</ol>

该技术适用于从分离的视网膜中记录任何视网膜神经节细胞（RGC）的电活动。尽管上述实验所用小鼠品系中，内在光敏性、表达黑视蛋白（melanopsin）的RGC已被EGFP标记2, 5，但本方案可轻松转移至其他荧光标记的RGC品系，也可推广用于随机选取的RGC记录。该技术特别有价值之处在于，每个RGC的树突分支及其相应的输入神经元均保持完全完整。记录可轻松在电流钳或电压钳模式下进行，也可采用细胞贴附式或松散封接式（loose-patch）构型，甚至可用于从视网膜神经节细胞膜上获取核膜片（nucleated patch）、膜内向外（inside-out）或膜外向外（outside-out）膜片构型。该技术可轻松调整用于记录荧光标记的移位无长突细胞7，甚至非移位无长突细胞8。利用荧光定位神经节细胞的一个局限性在于，在记录前必须始终以光照暴露视网膜以识别RGC。因此，除非灌流液中添加外源性发色团和/或保留眼杯及视网膜色素上皮与视网膜的连接9，否则该制备方法可能不适用于记录视杆细胞介导的反应。若目标是记录视杆细胞介导的光反应，则必须采取特殊预防措施以避免视紫红质...

<table><tbody><tr><td>Ames&amp;rsquo; 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS005273</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 肼</td><td>Invitrogen</td><td>A10442</td><td></td></tr><tr><td>神经生物素</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP1120</td><td></td></tr><tr><td>电极</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>眼科剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素 594</td><td>Invitrogen</td><td>S32356</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于记录遗传标记视网膜神经节细胞光反应的离体视网膜制备方法

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

脊椎动物视觉的最初步骤发生在光刺激视网膜的视杆细胞和视锥细胞时1。随后，这些信息被分为所谓的“ON通路”和“OFF通路”。光感受器将光信号传递给双极细胞（BCs），这些细胞在光强度增加（ON BCs）或减少（OFF BCs）时发生去极化。这种光信息的分离在视网膜神经节细胞（RGCs）层面得以维持，RGCs的树突分别在内丛状层（IPL）的OFF亚层中分层，直接接收来自OFF BCs的兴奋性输入，或在IPL的ON亚层中分层，直接接收来自ON BCs的兴奋性输入。关于光照增强或减弱的信息分离（即ON和OFF通路）被保守地并行传递至大脑。
视网膜神经节细胞（RGCs）是视网膜的输出细胞，因此研究这些细胞对于理解光信号如何传递至脑内视觉核团具有重要意义。近年来，小鼠遗传学的进展已催生出多种荧光报告小鼠品系，其中特定的RGC群体被荧光蛋白标记，从而可识别RGC亚型2 3 4，并实现电生理记录中的特异性靶向。本文介绍一种在完整、离体的视网膜制备标本中记录荧光标记神经节细胞光反应的方法。该离体视网膜制备标本可保留RGC的树突分支结构及其整个树突域上的输入连接，从而实现对RGC的记录。该方法适用于多种神经节细胞亚型，并可与多种单细胞生理学技术结合使用。

本文介绍了如何对小鼠离体视网膜进行解剖和记录。具体而言，我们描述了如何记录荧光标记的视网膜神经节细胞群体对光刺激的反应，并进一步识别和分析其形态学特征。

脊椎动物视觉的最初步骤发生在光线刺激视网膜的视杆细胞和视锥细胞光感受器时¹。随后，该信息被……

本实验的总体目标是从分离的小鼠视网膜中记录遗传标记的视网膜神经节细胞的光诱发反应。首先从小鼠眼球中分离出视网膜，完成第一步。实验的第二步是用酶处理视网膜，以去除残留的玻璃体。该实验步骤的第三步是将视网膜神经节细胞层朝上固定于记录室中，将记录室安装至显微镜载物台上，并识别基因标记的神经节细胞。实验的最后一步是对已识别的神经节细胞进行全细胞记录，并记录光刺激诱发的反应。最终，可通过单细胞膜片钳记录获得特定类型小鼠视网膜神经节细胞的功能特性结果，并明确其向大脑传递的信号特征。您好，我叫Tiffany Schmidt，是明尼苏达大学Paulo Ka Fuji博士实验室的一名神经科学专业的研究生。该技术可实现对特定基因标记的视网膜神经节细胞群体进行识别和记录，并进一步开展形态学分析。该技术有助于解答视觉领域中的关键问题，例如不同亚型的神经节细胞如何处理视觉刺激的关键特征。在实施手术之前。为了去除视网膜，首先需要配制实验所需的八种溶液。本实验所用所有溶液的成分均在随附文本中列出。将200毫升细胞外溶液转移至250毫升烧杯中，用于视网膜储存。将剩余的细胞外溶液放入分液漏斗中，用于记录期间的重力灌流。这两种溶液应始终维持在95%氧气和5%二氧化碳饱和的环境中。为了在实验过程中观察树突结构，可在细胞内溶液中加入荧光示踪剂，例如LOR 5 94。如果计划在全细胞记录后进行免疫组织化学实验，请在细胞内液中加入0.3%神经生物素。待所需溶液配制完毕后，采用二氧化碳窒息法处死小鼠，用弯头2号镊子轻轻从眼球后方插入并提起，摘除眼球。使用眼科剪清除眼外肌，并剪断视神经。将眼球置于盛有细胞外液的35毫米培养皿中。使用眼科剪剪除角膜，并用5号镊子取出晶状体。用5号镊子撕开巩膜，并在视网膜与巩膜交界处剪断剩余的视神经。用镊子在视网膜与巩膜之间的间隙中轻轻操作，将视网膜从眼杯上剥离。为节省时间，每个步骤应先在两只眼的视网膜上均完成后再进入下一步。一个关键步骤是去除附着在视网膜上的玻璃体。首先用镊子夹住视网膜上方透明的玻璃体开始操作。如果成功移除了玻璃体，你会在镊子尖端看到一小块透明的凝胶状物质。将每片视网膜切成两半，以最大化可利用组织的数量，并便于将视网膜安装到记录室中。将视网膜置于室温的充氧细胞外溶液中，并通过仅保留最低限度的环境光（如计算机屏幕发出的光）来减少光照暴露，视网膜在此条件下可保持活性约六小时。解剖后，从视网膜外组织所处的细胞外溶液中取出 500 微升。将一份胶原酶-透明质酸酶酶溶液加入其中并稀释。将酶溶液放入35毫米的培养皿中，并将其中一个已解剖的视网膜转移至该培养皿内。持续轻轻灌流95%氧气和5%二氧化碳混合气体，同时旋转培养皿15分钟。酶溶液可去除残留的玻璃体，从而更便于接近节细胞层。对于来自较年轻动物、玻璃体较少的视网膜，或若观察到不良反应时，消化时间可缩短至5分钟。使用剪

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