生成高度丰富的神经文化皮层组织块冷冻保存

大家好，我叫 Alan，是加州大学尔湾分校神经生物学和行为系 Horney Lu 博士的实验室。我是 Bob。今天，Haro 博士将向您展示一种快速、高效且可靠的方案，用于皮质组织块的常规冷冻保存，用于随后高质量原代神经元培养物的退化。

那么让我们开始吧。将清洁和切碎的组织加载到含有 10% TMSO 的冷冻瓶中。冷冻培养基。

将冻存管装入冷冻容器中，并在零下 80 摄氏度下放置至少 4 小时。然后将冷冻冻存管置于液氮中进行长期储存。对于培养，将 AC 冻存管在温水浴中熔化，并用温 HBSS 冲洗以去除剩余的 DMSO。

加入新鲜的 HBSS 和 tryin d ns 进行解离，然后加入含 10%EBS 的 DMM。为了停止解离酶活性，将细胞离心，将沉淀重悬于新鲜的 DMM 加 10%EBS 中，并接种在预包被的聚赖氨酸培养皿上。24 小时后，DMM 已转变为补充的神经基础培养基并生长 10 天。

该协议使用钢制剃须刀片在使用前切碎皮质组织。剃须刀必须在 70% 乙醇中消毒至少两个小时。通过在无菌水中稀释 10 x 储备溶液来制备 1 x Hank 缓冲盐溶液 HBSS，然后将 1 x X-H-B-S-S 保存在冰上或 4 摄氏度直至组织处理。

二甲基亚砜或 DMSO 用作冷冻介质中的低温保护。该方案使用 10% 体积的 DMSO 稀释液，并在 X-H-B-S-S-D-M-S-O 中稀释，应在 4 摄氏度下储存之前完全混合。Nalgene 和冷冻容器用于控制样品的冷冻速率。

冷冻容器装有事先贴标签的 2.5 毫升冻存管。如果您有多个冷冻容器，最好给冷冻容器贴上标签，并在胆汁上记下相应的容器。将先前冷却的 10%DMSO、冷冻培养基以及冷冻容器带入无菌生物安全柜中。

在这里，将 1 毫升冷冻培养基缓慢添加到每个冷冻瓶中确保瓶盖牢固后，在组织处理之前将装有冻存瓶的冷冻容器在 4 摄氏度下放置至少两个小时。先前消毒的剃须刀片需要彻底冲洗。三、三分钟的洗涤。

使用无菌水应足以去除任何残留的乙醇。这种清洗程序应该很快，因为剃须刀容易因长时间浸泡和无菌水而氧化。清洁前，应将纸巾放在冰袋上。

用冷的 X-H-B-S-S 轻轻冲洗，以去除任何自由漂浮的碎屑。消毒针头用于清洁任何剩余膜和血管的组织碎片。清洁时必须注意保持组织的结构完整性。

随着这的增加，切碎干净组织的效率将与原始组织明显不同，并且应该去除大部分膜或血管。清洁和冲洗纸巾后，就可以开始切碎了。将组织干净地切割成大约 1 立方大小的块非常重要。

太大的区块会导致解冻时的单元格产量降低。但是，还应避免较小的块过度处理。可以使用自动移液器和一些凉爽的 X-H-B-S-S 收集切碎的组织。

确保用 HBSS 冲洗培养皿以回收收集的所有组织。然后将组织加入大量 X-H-B-S-S 中，并使其落到底部，形成松散堆积的颗粒。这可以清除组织在 HBSS 中沉淀时可能存在的任何残留碎屑，在分配组织之前取回先前冷却的冷冻容器和冷冻瓶。

确保打开所有样品瓶的盖子，以加快填充纸巾的过程。在室温下暴露于 DMSO 的时间应限制在不超过 10 分钟。最好一次使用一个冷冻容器，直到所有组织都用完。

开始吸出松散组织的上层，将玉米颗粒尽可能靠近颗粒，不要打扰它。然后将 200 μL 宽的孔吸头安装到移液器上。不要使用较小的尖端孔口，因为它会损害通往组织块颗粒底部的块的结构。

缓慢收集 200 微升组织。将此组织添加到冷冻瓶中，然后移至下一个冷冻瓶，直到所有冻存管都装满。可能需要 10 分钟规则。

将冷冻容器快速放入低温冻存管中，置于零下 80 摄氏度的冷冻管中至少四小时，如果时间有限，则放置过夜。充分时间后，从冰箱中取出冷冻容器，并尽快将冻存管分配到冻存盒中。将冻存盒放在液氮盒架上长期储存。

尽快从液氮中取出低温液，限制冷冻箱暴露在室温下，浸入 37 摄氏度的水浴中，可快速熔化样品。始终保持盖子露出水面。经常检查并保持解冻，直到观察到小冰 P。

在将其带入安全柜之前，请用 70% 乙醇对低温灭菌。如果组织仍留在低温检查的壁上，则继续将解冻的组织加入大量温暖的 X-H-B-S-S 中。用 HBSS 轻轻收集。

收集完所有组织后。将试管倒置 3 到 4 次，让组织沉降到底部。此步骤可确保 DMSO 的充分稀释。

组织沉淀后，尽可能多地吸出 Super natin。然后加入 10 毫升温暖的新鲜 X-H-B-S-S。加入 300 微升 0.25% 胰蛋白酶和 50 微升 DNA。

继续以轻柔的搅动解离组织，在组织解离后产生混浊的细胞悬液。通过添加 1200 G 温热的 DM a 加 10% 富集牛血清 EPS 离心细胞悬液 5 分钟来终止酶活性。将细胞沉淀重悬于新鲜的 DMEM 加 10%EBS 中，并接种到聚赖氨酸包被的板上。

让细胞附着在培养皿上 30 分钟。然后用新鲜的 DM 加 10%EBS 替换培养基。24 小时后，用补充有 N 2 和 B 27 的神经基础培养基替换含有 DM 的培养基，并生长 10 天。

我们刚刚详细介绍了一个庞大、高效且可靠的方案，其中包含皮质组织块的常规哭泣保存。祝你好运。