生成高度丰富的神经文化皮层组织块冷冻保存

大家好，我叫Alan，来自加州大学欧文分校神经生物学与行为学系Horney Lu博士的实验室。我是Bob。今天，Haro博士将向大家展示一种快速、高效且可靠的常规冷冻保存皮质组织块的方案，用于后续制备高质量的原代神经元培养物。

那么我们开始吧。将清洗并切碎的组织放入含有10% TMSO冷冻保护液的冻存管中。

将冻存管放入冻存盒中，置于负80摄氏度环境中至少4小时。冷冻后的冻存管随后转移至液氮中进行长期保存。复苏软骨细胞冻存管时，将其在温水浴中融化，并用温热的HBSS冲洗，以去除残留的DMSO。

加入新鲜的HBSS以及用于解离的胰蛋白酶后，再加入含10% EBS的DMM。为终止解离性酶活性，将细胞离心沉淀，沉淀物重悬于新鲜DMM加10% EBS中，并接种至预先包被多聚赖氨酸的培养皿中。24小时后，将DMM更换为添加了补剂的神经基础培养基，并继续培养10天。

本方案在使用前采用钢制剃刀刀片切割皮质组织。该刀片必须在70%乙醇中灭菌至少两小时。通过将10倍浓度的储存液稀释于无菌水中制备1倍汉克斯平衡盐溶液（HBSS），该1× HBSS随后置于冰上或4°C保存，直至进行组织处理。

二甲基亚砜（DMSO）在冷冻培养基中用作冷冻保护剂。本方案使用体积分数为10%的DMSO，将其按1:10的比例稀释于H-B-S-S-D-M-S-O中，充分混匀后于4°C保存。使用Nalgene冷冻容器以控制样品的冷冻速率。

将预先标记好的2.5毫升冻存管装入冻存容器中。如果冻存容器有多个，建议对容器本身也进行标记，并在胆汁样本上注明对应的容器编号。预先冷却的10% DMSO冻存液以及冻存容器均移入无菌生物安全柜中。

将一毫升冻存液缓慢加入每个冻存管中。确保管盖拧紧后，将装有冻存管的冻存盒置于 4°C 环境中至少 2 小时，待组织处理前使用。预先灭菌的剃刀刀片需彻底冲洗，共进行三次，每次三分钟的洗涤。

使用无菌水足以去除残留的乙醇。该清洗步骤应迅速完成，因为刀片长时间浸泡在无菌水中容易发生氧化。清洁前应将组织置于冰袋上。

用少量冷的一倍X-H-B-S-S轻轻冲洗，以去除任何游离的碎屑。使用已灭菌的针头清除组织块上残留的膜和血管。在清理过程中需注意保持组织的结构完整性。

随着这一过程的进行，切割清洁组织的效率将明显不同于原始组织，且应已去除大部分膜结构或血管。一旦组织完成清洗和冲洗，即可开始切割。切割时需对组织进行整齐的切口，制备成体积约为一立方毫米的组织块。

过大的组织块在解冻时会导致细胞得率降低。然而，较小的组织块也应避免过度处理。可使用移液器收集切碎的组织，并加入少量预冷的1×HBSS。

务必用HBSS冲洗培养皿，以回收收集的所有组织。然后将组织加入大量一倍浓度的H-B-S-S中，并静置使其沉降至底部，形成松散的沉淀。当组织在HBSS中沉降时，可清除任何可能残留的碎片。在分配组织前，取出之前预冷的冻存容器和冻存管。

务必打开所有小瓶的盖子，以加快组织填充的速度。组织在室温下接触DMSO的时间应限制在不超过10分钟。建议每次只处理一个冻存容器，直至所有组织使用完毕。

开始吸取疏松组织的上清液，吸至尽可能接近沉淀，但不要扰动沉淀。然后将200微升大孔径吸头装到移液器上。切勿使用孔径更小的吸头，否则会破坏组织块沉淀底部的块状结构。

收集 200 微升组织液。将该组织加入一个冻存管中，然后继续下一个，直至所有冻存管装满。可能需要遵循 10 分钟规则。

迅速将冻存容器放入 cryo vials，并置于 -80 摄氏度超低温冰箱中至少 4 小时或过夜，若时间有限可选择后者。经过足够时间后，尽快从冰箱中取出冻存容器，并迅速将 cryo vials 分配至冻存盒中。将冻存盒放入液氮储存架中进行长期保存。

尽快从液氮中取出冻存管，尽量减少冻存盒暴露于室温环境，以防止样品迅速融化。将冻存管浸入37°C水浴中进行解冻，始终确保管盖位于水面之上。频繁检查样品，持续解冻至仅剩微小冰晶可见为止。

在将冻存管移入安全柜之前，使用70%乙醇对其表面进行消毒。如果解冻后的组织仍附着在冻存管管壁上，将其加入大量预热的1×HBSS中。用HBSS轻柔地收集组织。

所有组织收集完毕后，将离心管倒置三到四次，使组织沉降至管底。此步骤可确保二甲基亚砜（DMSO）得到充分稀释。

组织沉降后，尽可能吸除上清液。然后向其中加入 10 毫升温热的新鲜 1×H-BSS。加入 300 微升 0.25% 胰蛋白酶和 50 微升 DNase。

通过轻柔振荡进行组织解离，待组织解离后形成浑浊的细胞悬液。加入预温的含10%胎牛血清（EBS）的DMEM培养基以终止酶活性，将细胞悬液在1200 ×g条件下离心5分钟。将细胞沉淀重悬于新鲜的含10%EBS的DMEM培养基中，并接种至多聚赖氨酸包被的培养板中。

让细胞在培养皿中贴壁30分钟，随后更换为新鲜的DM培养基并添加10% EBS。24小时后，将含有DM的培养基更换为添加了N2和B27的神经基础培养基，并继续培养10天。

我们刚刚详细介绍了一种高效、可靠的常规皮质组织块冷冻保存方案。祝您好运。