Name: 在哺乳动物细胞通过显微注射mRNA的核出口动力学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 了解哺乳动物细胞中mRNA核出口动力学的显微注射与荧光原位杂交方法。该技术可精确量化mRNA从细胞核向细胞质的转运速率，为转录后调控机制研究提供定量数据。

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我们感谢 E. Gomes 提供的有益建议，以及 A. Wilde 允许我们使用各种设备。本研究得到了加拿大卫生研究院（FRN 102725）向 A.F.P. 提供的资助支持。

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<li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

显微注射是一种强大的工具，可用于研究多种不同的细胞过程。与传统的细胞转染不同，显微注射使研究人员能够在极短的时间内将核酸有效地导入细胞核内。因此，可以进行动力学分析，例如测定mRNA输出速率、mRNA定位以及蛋白质合成速率。此外，由于实验时间相对较短，可以在短时间内使细胞暴露于有毒化合物而不引发多效性效应。而且，抑制性或刺激性化合物（如显性负性蛋白）可与核酸共同注射。最后，显微注射避免了使用转染试剂的需求，而这些试剂通常对细胞具有毒性，并可能干扰不同的细胞功能。
mRNA 与质粒 DNA 注射
注射何种核酸取决于多种因素。在注射质粒DNA后，RNA聚合酶II不仅合成mRNA，还会募集蛋白质因子至新生转录本12,13由于这些因素调控着mRNA加工、核输出和细胞质定位等事件，因此可通过质粒DNA注射来评估转录如何与下游过程相偶联。尽管转录可能与核输出相偶联14，我们发现注射的mRNA比 体内 转录的mRNA6目前尚不清楚其具体原因，但这一结果可能表明，新合成的mRNA在从RNA聚合酶II上释放后，可能被结合在某些复合物中，从而阻碍了其核输出。
mRNA注射具有一些优势。首先，研究人员无需使用RNA聚合酶抑制剂，这类抑制剂可能会影响细胞对RNA整体代谢的调控。其次，RNA可以进行修饰 体外 注射前。例如，可通过合成带有不同5'帽类似物或不同长度poly(A)尾的mRNA，以评估这些特征对核输出的影响6第三，所注射的 RNA 确切数量可进行粗略估计。根据上述方案，我们估计每个细胞核中大约注射了 20,000 至 50,000 个分子，与典型哺乳动物细胞中转录本的总数（400,000 至 850,000 个分子）相比，这一数量相对较少。15mRNA注射的主要缺点是在显微注射过程中，注射液不可避免地会部分泄漏到细胞质中。由于直接注入细胞质的mRNA在较长时间内保持稳定（A. Palazzo，未发表观察），因此必须格外谨慎地选择用于定量分析的细胞。通常我们分析那些接受 &gt;通过OG-葡聚糖的分布评估，90%的注射液位于细胞核内。

<table><tbody><tr><td>注射缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>140 mM KCl 和 10 mM HEPES，pH 7.4</td></tr><tr><td>Oregon Green 488-70kD 右旋糖酐</td><td>Invitrogen</td><td>D7173</td><td>在注射缓冲液中配制成 10 mg/ml 的储存液，可在 -80&amp;#x00B0;C 长期保存</td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>用于填充注射针头的凝胶加样枪头</td><td>Eppendorf</td><td>022351656</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige International</td><td>NT-88-V3MSH</td><td></td></tr><tr><td>注射用注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>512311</td><td></td></tr><tr><td>PBS 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td></tr><tr><td>SSC 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>150 mM NaCl, 15 mM 柠檬酸钠, pH 7.4</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td>将 37% 多聚甲醛储存液用 PBS 稀释</td></tr><tr><td>0.1% Triton X-100（Surfact-Amps）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28314</td><td>将 10% Triton X-100 储存液用 PBS 稀释</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>钒酰核糖核苷复合物（VRC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3380</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td></td></tr><tr><td>防振台</td><td>Kinetic Systems</td><td>5702E-3036-21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-鹅膏蕈碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>真空润滑脂</td><td>Dow Corning</td><td>695400008</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>聚(A)聚合酶</td><td>Ambion</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>杂交缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100 mg/ml 硫酸葡聚糖, 5 mM VRC, 150 mM NaCl, 15 mM 柠檬酸钠, 0.5 mg/ml &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA, 60% 甲酰胺</td></tr></tbody></table>

哺乳动物细胞中mrna核输出动力学的显微注射分析

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

在真核生物中，信使RNA（mRNA）在细胞核内转录，必须被转运至细胞质中才能接触翻译机制。尽管mRNA的核输出已在多种体系中被广泛研究 非洲爪蟾卵母细胞1 以及遗传操作简便的生物体，如酵母2 和 果蝇 衍生S2细胞系3，但在哺乳动物细胞中的研究还很少。此外，哺乳动物体细胞中mRNA出核转运的动力学过程只能通过间接方法推断4,5为了测量mRNA在哺乳动物组织培养细胞中的核输出动力学，我们开发了一种检测方法，该方法结合了显微注射与荧光技术的优势 原位 杂交（FISH）。这些检测方法已被用于证明，在哺乳动物细胞中，大多数mRNA以依赖剪接的方式被输出6,7，或以需要特定RNA序列（如信号序列编码区，SSCR）的方式 6在此实验中，细胞被显微注射以下任一物质 体外 含有目的基因的合成mRNA或质粒DNA。显微注射后的细胞在不同时间点孵育后固定，并通过FISH检测RNA的亚细胞定位。与转染技术中核酸加入后数小时才开始转录不同，DNA或mRNA的显微注射可实现快速表达，从而获得精确的动力学数据。

本文介绍了一种检测方法，该方法结合显微注射与荧光原位杂交技术，以准确测定哺乳动物体细胞中mRNA的核输出动力学。

哺乳动物细胞中mRNA核输出动力学的显微注射分析

在真核生物中，信使RNA（mRNA）在细胞核内转录，必须被转运至细胞质中才能接触翻译机制。尽管……

本实验的总体目标是测量哺乳动物细胞中 mRNA 核输出的动力学过程。首先将 mRNA 或 DNA 显微注射到哺乳动物组织培养细胞的细胞核内，完成显微注射后，在不同的孵育时间点对样品进行固定。然后通过荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization）或 fish 对 mRNA 进行染色。该实验步骤的最后一步是成像细胞，并定量细胞质和细胞核中的荧光量。最终，可通过显微注射与荧光显微镜技术的结合来测量 mRNA 的出核转运速率。大家好，我是来自多伦多大学生物化学系Alex Palazzo实验室的SRG AV。我是Stefan Toski，也来自Palazzo实验室。我是Palazzo实验室的Amy，这位是Palazzo实验室的Khi Maha David。今天，我们将向您展示一种通过显微注射将 mRNA 导入哺乳动物组织培养细胞细胞核的实验方法。我们还将演示如何通过荧光原位杂交对 mRNA 进行染色。在我们的实验室中，利用这些方法研究哺乳动物细胞中 mRNA 核输出的动力学过程。下面我们开始。在显微注射之前，将先前制备好的质粒DNA用注射缓冲液稀释至每毫升50至200微克。接下来，向混合物中加入Oregon Green 488（OG）标记的70千道尔顿葡聚糖，以便识别已注射的细胞。使用OG偶联葡聚糖可帮助确定注入细胞核的液体量以及泄漏到细胞质离心机中的液体量。将样品在13,000 G和4摄氏度条件下离心至少20分钟，以沉淀可能堵塞针尖的任何颗粒物质。根据书面方案中描述的标准和成本，选择适合显微注射的哺乳动物细胞系。本实验以七个细胞作为示范种子。细胞需在微注射前至少24小时接种于30毫米培养皿中经酸洗处理的盖玻片上。理想情况下，注射时细胞单层应达到约70%至90%融合度，以便于识别已注射的细胞；在注射前，使用200微升塑料移液枪头对细胞单层进行划痕处理以造成损伤。在盖玻片上刻划一个十字形划痕，然后将细胞置于组织培养孵育箱中恢复至少15分钟，再进行注射。进行显微注射时，使用倒置显微镜，并将其放置在隔振气浮台上，以尽量减少可能干扰显微注射过程的振动。使用 einor 凝胶加样枪头，从离心样品的上清液顶部吸取约一微升液体，避免扰动沉淀物。将移液器的尖端插入预制显微注射针的后端并推出液体。液体将通过毛细作用被吸入针尖。在5至30秒内，应在针尖附近观察到弯月面。将装有液体的针插入持针器，并用显微操作仪夹紧。以45度角使用10倍物镜观察针头，将其置于视野中央，靠近焦平面。通过粗调显微操作仪旋钮，持针器经导管连接至玻璃注射器，利用该注射器产生压力，将液体从针尖推出。为保持稳定的压力，将注射器安装到管夹上。使用两个橡胶塞和两个金属夹，将针头抬高几毫米，以防止其在后续步骤中受损，然后将显微镜向后推。柱状结构处，通过按压注射器活塞来增加压力。0.5 至 2 立方厘米。将含有盖玻片的培养皿（盖玻片上带有划痕的单层细胞）放置在观察台上，然后将显微镜向后移开。将柱体向前推至直立位置，使冷凝器对准针头，以便针头进入液体。操作时应小心谨慎，防止针头在盖玻片上折断。使用10倍物镜，确定十字交叉处的中心，并将针头定位在待注射细胞的上方。通过切换到40倍物镜来增加放大倍数。然后使用操纵杆上的微调旋钮降低并居中针头。从伤口十字的一角开始注射，降低针头使其接触细胞核。注射后，细胞的相位亮度会发生显著变化。沿伤口横截面的一侧继续操作。为了在观察过程中易于识别已注射的细胞，至关重要的是针对每根针头适当调整注射压力。压力必须足够高以穿透细胞质膜和核膜，但又不能过高而杀死细胞。沿伤口边缘对细胞进行显微注射，持续固定时间。经过练习，可在该时间段内完成数百个细胞的注射。若注射质粒DNA，则在固定前将显微注射的细胞置于37摄氏度的组织培养箱中孵育20分钟，随后终止转录。通过用含有1微克/毫升α-鹅膏蕈碱（alpha-amanitin）的生长培养基处理细胞，该浓度可有效抑制从显微注射质粒产生的转录。将细胞放回培养箱中，使细胞能够输出新合成的mRNA。同一根针头可重复用于注射多个盖玻片。但当显微注射的DNA或RNA类型发生变化时，需要更换针头。此外，一旦将针头从移液棒上取下，应立即弃置，以获得准确的 mRNA 核输出动力学测量结果。应分别在 0 分钟、15 分钟、30 分钟、60 分钟和 120 分钟固定不同的样品。在相应时间点进行 α-放线菌素处理后，吸除培养基，并用 2 毫升 PBS 溶液洗涤细胞两次。保持盖玻片湿润非常重要，应尽量减少其未浸入液体的时间。通过加入2毫升4%多聚甲醛（PBS配制）固定细胞，在室温下孵育至少15分钟。固定后的样品再用PBS洗涤两次，随后使用2毫升含0.1% Triton X-100的PBS对细胞进行透化处理，并再次于室温孵育至少15分钟。最后再清洗样品两次，以准备进行杂交。用含有25%至60%甲酰胺的1×SSC溶液洗涤缓冲液将细胞洗涤两次。然后通过在直径150毫米的培养皿底部加入水，并在水面上漂浮一片对苯二甲醛膜，制备用于杂交的染色室。通过将培养皿倒置来去除水分，从而使包埋的组织贴附在培养皿底部。对每一张待染色的盖玻片，手动去除所有气泡。用移液器将100微升杂交溶液滴加到包埋的组织上。请注意，应使用镊子针对所用特定鱼类蛋白优化凝胶的用量。从 30 毫米培养皿中取出带有固定细胞的盖玻片。用沃特曼滤纸擦干盖玻片背面，并从正面吸去多余的缓冲液，但不要使细胞干燥。然后将盖玻片正面朝下放置在鱼溶液上。对每个盖玻片重复此操作。重新盖上染色室的盖子后，将样品在37摄氏度下孵育5至18小时。以与制备染色 chamber 相同的方式准备多个洗涤 chamber，对每个盖玻片，向洗涤 chamber 的对位处加入一毫升洗涤缓冲液。孵育结束后，用移液器吸取一毫升洗涤缓冲液，将盖玻片从染色 chamber 中取出。紧邻盖玻片处，应通过毛细作用将液体引至每个样本下方。然后用镊子取下盖玻片，将每一片置于一滴已预置于室温孵育5分钟的洗涤缓冲液中。每片盖玻片再重复洗涤两次，共洗涤三次。用移液器吸取10至30微升含DAB的封片液，滴加到先前已洗涤的载玻片上。每张载玻片可容纳两片盖玻片，使用镊子和沃特曼滤纸进行操作。将盖玻片背面干燥，并从盖玻片正面用吸水纸吸去多余液体，但不得使样品干燥。将每张盖玻片正面朝下置于一滴封片液上。封片后的样品可于4°C保存。此处展示了α-黑镰孢菌素（alpha mantin）对转染质粒DNA转录的影响，所用NIH 3T3成纤维细胞经不同浓度α-黑镰孢菌素预处理后，转染了TFL s Δi质粒DNA以及OG偶联的70千道尔顿葡聚糖。每行对应一个视野，分别成像检测OG 70千道尔顿葡聚糖和T uts ΔI mRNA。显然，高浓度的药物完全抑制了T UTS delta I转录本的产生，而在较低浓度下则未观察到此现象。此处显示的是mRNA核输出成本的时间过程。七个人工授精细胞被注射了T UTS delta i质粒DNA和OG偶联的70千道尔顿葡聚糖。注射细胞30分钟后，用α-黑麦草碱（alpha mantin）处理，并在37°C下分别孵育0分钟、60分钟和120分钟。随后对细胞进行固定，并使用针对T UTS delta I mRNA的探针以及针对内质网标志物TRAPα的抗体进行染色。每一行对应一个单独的细胞视野。有关如何定量 mRNA 输出的信息，请参见此处的在线文本。为展示 TFS delta I mRNA 在内质网中的共定位，将 120 分钟时间点放大，显示绿色的 T UTS delta I mRNA 与红色的 TRAP alpha 的叠加图像。有关如何对 mRNA 与蛋白质进行共染色的信息，可参见在线文本。我们刚刚向您展示了如何通过显微注射来测量 mRNA 的核输出动力学。在执行该操作时，需要牢记成功完成显微注射依赖于充分的准备工作。DNA 和 RNA 制备、样品处理、拉制针头、校准光学设备以及显微注射过程中的故障排除等关键步骤，均已在我们的书面实验方案中有详细描述。在对显微注射的 mRNA 进行成像和分析时，必须确保定量仅限于那些将超过 90% 注射液体导入细胞核的细胞。可通过观察核内和细胞质中器官绿葡聚糖的分布情况来评估核注射是否成功。有关设计鱼类探针以及使用图像分析软件分析细胞质和细胞核中 mRNA 分布的更多信息，请参考我们的在线实验方案。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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