慢病毒转导神经前体细胞以调控α-突触核蛋白表达的表观遗传机制

在恒温金属浴中解冻保存在冷冻保护剂中的神经前体细胞（NPCs）。

这些神经元前体细胞表达升高的α-突触核蛋白，这是帕金森病的一个关键因素。

将解冻的细胞转移至含有预温培养基的离心管中，以稀释冷冻保护剂。

离心以沉淀细胞，弃去上清液，并将沉淀重悬于神经细胞培养基中。

将细胞悬液加入经细胞外基质包被的多孔板中，孵育以促进细胞贴壁和增殖。

加入含有向导RNA、失活的Cas9- DNA甲基转移酶以及抗生素抗性基因的慢病毒载体。

孵育以促进病毒进入、病毒RNA的逆转录、整合至宿主基因组以及外源基因表达。

向导RNA将dCas9引导至α-突触核蛋白基因，在此处由甲基转移酶介导的DNA甲基化降低α-突触核蛋白的表达。

更换为含抗生素的神经培养基，以筛选转导细胞，未转导的细胞则发生凋亡。

将装有 MD NPC 的冻存管置于 37 摄氏度的加热块中两分钟，然后将解冻的细胞转移至含有 10 毫升预热的 DMEM-F12 的 15 毫升锥形管中。

在300 ×g下离心5分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于2毫升预热的完全N2B2培养基中。向细胞悬液中加入2毫升N2B27，然后将2毫升细胞悬液接种至预先制备的BMM包被的6孔板的每个孔中。

在37摄氏度、5% CO_2条件下将细胞孵育过夜。当MD NPCs达到70%融合度时，加入两微升慢病毒向导RNA d-Cas9-DNMT3A载体进行转导，并轻轻摇晃培养板。转导后48小时，在相同条件下继续孵育16小时，随后更换N2B27培养基。

加入含 5 微克/毫升嘌呤霉素的 N2B27