一种用于定量细菌中无机多聚磷酸盐的检测方法

无机多聚磷酸盐（polyP）是一种线性磷酸盐聚合物，参与细菌的毒力和应激反应，以细胞质颗粒形式储存。

为了定量多聚磷酸盐（polyP），取一块多孔板，其中含有浓度递增的无机磷酸盐标准品。

将纯化的细菌多聚磷酸盐提取物加入空孔中。

向每个孔中加入含有外切聚磷酸酶的反应缓冲液，并进行孵育。

该酶将聚磷酸盐（polyP）切割为游离的无机磷酸盐，从而转化为可定量的形式。

加入含有钼酸盐和抗坏血酸的检测试剂，并孵育。

钼酸盐与磷酸盐反应生成磷钼酸复合物，该复合物被抗坏血酸还原为蓝色复合物。

测定有色复合物的吸光度。所测得的吸光度对应于蓝色的深浅，其与磷酸盐浓度成正比。

生成标准曲线并计算样品的磷酸盐水平，以反映细菌原始的聚磷酸盐含量。

首先配制标准品，其中分别含有 0、5、50 或 200 微摩尔/升磷酸钾，溶剂为 50 毫摩尔/升、pH 8 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）。

取每种磷酸盐标准品各100微升，以及提取的聚磷酸盐样品各100微升，分别加入透明96孔板的不同孔中。按每份样品配制主混合液：30微升5X ScPPX反应缓冲液、19微升水和1微升纯化的ScPPX。向96孔板的每个孔中加入50微升该主混合液。

在37摄氏度下孵育15分钟。在检测当天，通过将9.12毫升检测溶液基础液与88毫升1摩尔抗坏血酸混合，配制新鲜的检测工作液，并在使用前使其恢复至室温。向96孔板中的每个样品和标准品中加入50微升检测溶液。

为使颜色充分显色，将酶标板在室温下孵育约两分钟。使用酶标仪在882纳米波长处测定吸光度，并通过与磷酸钾标准曲线比较，计算各样品中磷酸盐的浓度。随后将磷酸盐浓度转换为每份细胞裂解液中来源于聚磷酸盐（polyP）的磷酸盐纳米摩尔数，并根据文中所述方法，将细胞内polyP含量归一化至总细胞蛋白量。