一种用于革兰氏阳性菌抗生素敏感性检测的肉汤微量稀释法

从培养皿中分离革兰氏阳性细菌菌落，并将其悬浮于培养基中。

将悬液稀释至适合该检测的最佳细菌浓度。

将含有脂糖肽类抗生素浓度递增的微孔板中的检测孔，以及仅含培养基的生长对照孔进行接种。

取对照孔中的等分试样涂布于培养平板，以验证培养物的纯度并进行细菌计数。

孵育以促进细菌生长，在此期间合成细胞壁。

该抗生素与肽聚糖（细胞壁组分）及其前体结合，抑制其聚合，从而削弱细胞壁。

这种破坏使得渗透压导致细胞裂解。

孵育后，确认培养物的纯度和最佳细菌数量。

检查各孔中是否有细菌生长。

对照孔显示可见的菌体生长，而测试孔中能够完全抑制菌体生长的最低抗生素浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。

在本演示中，将接种一个新制备的平板。为制备接种物，从培养18至24小时的血琼脂或其他非选择性琼脂平板上，挑选数个分离良好的菌落。此处使用的是质控菌株 S. aureus 和 E. faecalis。

用无菌拭子接触每个菌落的顶部，并将部分菌落转移至含有1至5毫升CAMHB或生理盐水的试管中。持续转移，直至菌液浊度在配制后15至30分钟内达到0.5麦氏标准。将接种物在CAMHB中稀释1至100倍，最终浓度为每毫升5×10⁵ CFU。可接受范围为每毫升2×10⁵至8×10⁵ CFU。

立即使用带无菌吸头的多通道移液器，将终末接种物各 50 微升转移至 MIC 面板板的相应孔中。此处，每种分离株分别接种四行，每种分离株共设四个重复。接下来，为进行纯度检查，使用移液器将阳性生长对照溶液中的 1 至 10 微升转移至非选择性琼脂培养基，例如含 5% 羊血的胰蛋白酶大豆琼脂。

使用无菌接种环将溶液均匀涂布于平板表面。将平板旋转90度后再次划线，以确保接种物均匀分布。盖上平板并置于一旁。

在进行菌落计数前，使用单通道移液器将生长对照孔中的溶液10微升转移至10毫升生理盐水中，混匀后取100微升，用无菌接种环转移至适当的非选择性琼脂培养基（如含5%羊血的胰蛋白酶大豆琼脂）表面，并将溶液均匀涂布于整个琼脂表面。为确保接种物均匀分布，需在不同方向重复此涂布过程两次。接下来，将最多四块MIC板叠放在塑料容器中，并确保最上方的MIC板用盖子严密密封。

接种后30分钟内，将一张湿润的纸巾放入塑料容器中，并用盖子严密封闭。将MIC板、菌落计数平板和纯度检查平板置于普通空气孵育箱中，在35±2°C条件下孵育16至20小时。次日，通过肉眼观察，以完全抑制孔中细菌生长的最低浓度读取最低抑菌浓度（MIC）。

确定菌落计数平板上的菌落数量。将计得的菌落数乘以稀释倍数。例如，50 个菌落乘以 10,000 的稀释倍数，结果为每毫升 5 × 10⁵ CFU。

可接受的菌落数范围为20至80个，相当于每毫升2到8乘以10的5次方个菌落形成单位。接种物的浓度是控制药敏试验以获得准确结果的重要变量。最后，检查纯度平板。

如果所有菌落均与用作接种物的菌落相似，则可视为纯培养。如果存在其他类型的菌落，则MIC板中可能存在污染物，应重复实验。