一种用于革兰氏阳性菌抗生素敏感性试验的肉汤微量稀释法

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从培养板中分离革兰氏阳性细菌菌落并将它们悬浮在培养基中。

释悬浮液以达到测定的最佳细菌浓度。

种含有增加浓度的脂糖肽抗生素的微孔板和仅含有培养基的生长对照孔的测试孔。

将对照孔中的等分试样涂抹到培养板上,以验证培养纯度和细菌计数。

孵育以允许细菌生长,在此期间合成细胞壁。

抗生素与肽聚糖(一种细胞壁成分)及其前体结合,抑制聚合并削弱细胞壁。

这种破坏允许渗透压引起细胞裂解。

孵育后,确认培养纯度和最佳细菌计数。

检查孔是否有细菌生长。

对照孔显示可见生长,而完全抑制生长的抗生素浓度最低的测试孔表示最小抑制浓度 (MIC)。

在此演示中,将接种一个新鲜制备的板。要制备接种物,请从18至24小时血琼脂或其他非选择性琼脂平板中选择几个充分分离的菌落。在这里,使用质量控制金黄色葡萄球菌和粪肠杆菌菌株。

用无菌拭子触摸每个菌落的顶部,并将其中的一部分转移到含有一到五毫升 CAMHB 或生理盐水的管中。继续转移,直到浊度在制备后 15 至 30 分钟内达到 0.5 麦克法兰标准,在 CAMHB 中将接种物稀释 1 至 100,以达到每毫升 10 倍至第五 CFU 的最终浓度。可接受的范围是每毫升 10 到 5 CFU 的 2 到 8 倍。

立即使用带有无菌吸头的多通道移液器,将 50 微升最终接种物转移到 MIC 面板板的每个适当孔中。在这里,用两种分离株中的每一种接种四行,每个分离株总共四次重复。接下来,要进行纯度检查,请使用移液器将阳性生长对照中的 1 至 10 微升溶液转移到非选择性琼脂中,例如含有 5% 羊血的胰蛋白酶大豆琼脂。

使用无菌环将溶液铺在板表面上。将板旋转 90 度并再次划线以确保接种物均匀分布。盖上盘子,放在一边。

在准备菌落计数时,使用单通道移液器将生长对照孔中的10微升溶液转移到10毫升盐水混合物中,然后将100微升转移到合适的非选择性琼脂培养基中,例如使用无菌环将含有5%羊血的胰蛋白酶大豆琼脂,将溶液铺布在整个琼脂表面。在不同方向上重复此过程两次,以确保接种物的均匀分布。接下来,将最多四个 MIC 面板堆叠在一个塑料容器中,确保顶板用盖子紧密密封。

然后在塑料容器内放入湿纸巾,并在接种后 30 分钟内盖上盖子。将MIC面板,菌落计数板和纯度检查板在35正负2摄氏度的环境空气培养箱中孵育16至20小时。第二天,将最低抑制浓度解读为肉眼检测到的完全抑制孔中细菌生长的最低浓度。

确定菌落计数板上的菌落数量。将计数的数字乘以稀释系数。例如,50 菌落乘以稀释因子 10, 000 等于每毫升第五个 CFU 的 5 乘以 10。

可接受的范围是 20 到 80 个菌落,相当于每毫升 10 到 5 个菌落形成单位的 2 到 8 倍。接种物的浓度是控制药敏试验以获得准确结果的重要变量。最后,检查纯度板。

如果所有菌落都与用作接种物的菌落相似,那么它可以被认为是纯的。如果存在任何其他菌落,则 MIC 面板中可能存在污染物,应重复测试。

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Last updated: 18 July 2026