在铁限制条件下培养结核分枝杆菌

从含有在营养增强培养基上培养的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）菌落的琼脂平板开始。

将单个菌落接种至含营养补充物的肉汤培养基中，并在振荡条件下培养以获得均匀生长。

让培养物达到对数生长后期，此时细胞处于旺盛的代谢状态。

用移液器吸取少量样品滴加到富集型琼脂平板上，均匀涂布，并培养至形成连续的细菌层。

用低铁最低培养基（LIMM）润湿一支无菌棉签，并收集细菌。

将它们悬浮在含有LIMM的塑料容器中，以避免铁污染。

加入分散剂以防止结块，并在不振荡的情况下孵育。

在铁限制条件下，细菌会激活应激反应并在细胞质中产生铁载体。

这些物质被包装到细胞外囊泡中，并释放到周围环境中。

铁载体可捕获铁，帮助细菌存活。

该系统揭示了分枝杆菌在铁限制条件下的适应与生存机制

取一单个结核分枝杆菌菌落接种于2 mL添加了ADN增菌剂的分枝杆菌液体培养基中。在37°C条件下振荡培养。当出现可见生长时，取2 mL培养物，在分光光度计上测定其OD 540值。

当 OD 540 达到 0.8 时停止培养，这表明已进入对数生长后期。取 200 µL 对数生长后期的培养物，均匀涂布于添加了 0.2 甘油、0.5% 吐温 80 和 ADN 的分枝杆菌琼脂平板上。至少接种五块平板。

将培养皿在37摄氏度下孵育。一周后，细菌生长形成可见的融合层。然后用低铁最低培养基润湿一支无菌棉签。

使用该拭子从琼脂平板上收集细菌。将细菌接种于试管中含100毫升低铁最低培养基的液体中。收集足够的细菌，制备OD 540为1的菌悬液。

用低铁最低培养基将悬浮液稀释10倍至1升，并分装到两个无菌塑料瓶中。接着，将2毫升培养物转移至5毫升培养管中。加入10微升体积分数为10%的tyloxapol。

将培养物在 37 摄氏度下孵育 14 天。