使用尺寸排阻色谱法分离细菌细胞外囊泡

0 次观看3:24 分钟 • September 26th, 2025

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取尺寸排阻色谱柱或 SEC 色谱柱,填充有规定尺寸的多孔树脂珠。它的顶部包含一个样品储液器。

加入磷酸盐缓冲盐水或PBS以平衡色谱柱珠,并丢弃流通液。

加载含有细胞外囊泡或 EV、分泌蛋白和污染物的浓缩细菌培养滤液。

EV是基于脂质的纳米囊泡,携带生物活性分子,由细菌分泌。

滤液进入磁珠后,添加PBS使其通过树脂床。

丢弃含有大非囊泡污染物的初始洗脱液。

将收集管放在出口下方并依次添加PBS。

大尺寸的 EV 避开较小的树脂孔隙,穿过珠子之间的颗粒间空间,然后首先洗脱。

较小的蛋白质和污染物进入孔隙,沿着更长的路径,稍后洗脱。

收集含有EV的早期洗脱馏分并储存它们以供分析。

对于EV的分离,使用床容积为10毫升的小色谱柱对小于100毫升的起始材料进行尺寸排阻色谱或SEC,使用床容积为47毫升的大色谱柱对超过100毫升的起始材料进行尺寸排阻色谱或SEC。在实验前几个小时内,将SEC色谱柱和PBS置于室温,然后使用标准实验室支架和支架将色谱柱稳定在垂直位置。在连接到SEC色谱柱之前,通过让5毫升PBS流过熔块流入废物容器来水合样品储液器。

然后,拧下色谱柱的入口盖,向样品储液器中加入两毫升PBS,并在PBS通过熔块滴出时小心地将储液器连接到色谱柱。为了平衡色谱柱,向样品储液器中加入 47 毫升 PBS,然后打开 SEC 色谱柱底部的盖子。然后,让所有加载的样品缓冲液流过色谱柱并丢弃流通液。

将两毫升样品加载到样品储液器上后,让样品完全进入色谱柱并收集流通液。立即将 PBS 以 14.25 毫升减去样品体积的体积添加到样品储液器中,以使溶液流过色谱柱,同时丢弃等于色谱柱空隙体积的量。接下来,将一个两毫升低结合微管放置在SEC色谱柱的正下方,以收集第一个流通或馏分一,然后让两毫升PBS流过色谱柱。

继续向样品储液器中加入两毫升PBS以收集每个后续馏分。将收集的馏分储存在 4 摄氏度以进行短期储存,或将收集到零下 80 摄氏度以进行长期储存。

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最后更新:1 八月 2026