从大鼠肺内皮细胞细菌感染后获取细胞毒性淀粉样蛋白

取一层大鼠肺微血管内皮细胞。

用缓冲液洗涤细胞。加入铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）悬液并进行孵育。

孵育期间，细菌与细胞接触并将效应蛋白注入细胞质中。

这些效应蛋白可诱导微管解聚和细胞骨架破坏。

细胞骨架的破坏会激活细胞应激反应，导致错误折叠的细胞毒性蛋白聚集物——淀粉样寡聚体的形成。

效应蛋白还在细胞膜上形成孔道，使淀粉样寡聚体释放到细胞外空间。

此外，细胞骨架的破坏会改变细胞形态，在内皮单层中形成细胞间间隙。

接下来，在光学显微镜下观察单层细胞。一旦细胞间间隙变得明显，即终止孵育。

然后，收集含有细胞毒性淀粉样蛋白的上清液，并离心以沉淀残渣。

收集上清液并过滤，以去除任何残留的细菌。

含有细胞毒性淀粉样蛋白的收获上清液已准备好进行进一步分析。

为制备具有细胞毒性的上清液，用HBSS洗涤一个150厘米的内皮细胞培养皿，并将一株P. aeruginosa菌落稀释至540纳米处的吸光度为0.25。进一步稀释细菌，使其在20毫升HBSS中达到20:1的感染复数，然后将细菌接种到内皮细胞培养板上。随后将感染后的细胞置于37摄氏度、5% CO₂的培养箱中孵育4至5小时。

细菌与内皮细胞的孵育时间必须恰当，这一点至关重要。如果孵育时间过短，淀粉样蛋白将不会释放到上清液中；如果孵育时间过长，细胞实际上会发生裂解，将其所有内容物释放到上清液中。我们用来判断孵育时间是否合适的指标是内皮单层细胞中出现间隙。

当通过光学显微镜观察到细胞单层出现间隙时，收集上清液进行离心，以去除细胞碎片。将上清液倒入配备有0.2微米滤器的注射器中，过滤上清液以去除可能存在的细菌污染。

然后取 1.5 毫升无菌上清液用于细胞毒性检测，并将剩余样品于 -80 摄氏度冷冻保存。