生成用于靶向基因敲除的Pseudomonas aeruginosa双交换重组子

从含有抗生素筛选培养基的重组Pseudomonas aeruginosa培养物开始。

这些细菌含有一个非复制型质粒，该质粒已整合到基因组中，位于拟敲除的细菌靶基因附近。

整合通过质粒与基因组之间的同源序列发生，导致单次交换重组。

该质粒编码一种抗生素抗性基因和 sacB 基因，后者赋予蔗糖敏感性。

将细菌划线接种到含有蔗糖但不含抗生素的培养基上，并进行培养。

在没有抗生素压力的情况下，同源区域之间会发生第二次重组或双交换，从而切除质粒和靶基因。

在细菌繁殖过程中，被切除的质粒不会传递给子代，从而使细菌具有蔗糖耐受性。

将细菌接种至非选择性培养基以及含蔗糖或抗生素的培养基上，然后进行培养。

在非选择性培养基和蔗糖培养基上生长，但在含抗生素培养基上不生长，表明双交换成功。

首先在Pseudomonas分离肉汤（PIB）中培养单交换重组菌落。将每种培养物取10 µL接种并划线于预热的PIA平板上，平板中添加10%蔗糖。然后在37°C条件下过夜培养平板。

第二天，从培养箱中取出平板，检查菌落生长情况。蔗糖抗性菌落应为双交换重组子。使用无菌牙签将至少20个菌落分别转接到预热的PIA平板、含10%蔗糖的PIA平板以及含羧苄青霉素的PIA平板上。

将培养皿孵育过夜，次日观察其生长情况。真正的双交换重组子将对羧苄青霉素敏感，但对蔗糖具有抗性。