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微生物学
0 次观看 • 5:46 分钟 • September 26th, 2025
取一个微流控板，其孔中含有链霉菌（Streptomyces venezuelae）的孢子，这是一种可形成菌丝的细菌。
其他指定的孔中则含有营养丰富的培养基或用过的培养基。
孢子来源于一种表达荧光 DivIVA 和 FtsZ 蛋白的菌株，这两种蛋白分别定位于菌丝尖端和隔膜处。
在倒置显微镜的物镜和培养板的成像窗口上滴加镜油。
将培养板安装在显微镜载物台上，开始延时成像。
将孢子接种到培养板的培养室中。
然后，加入富含营养的培养基以启动孢子萌发。
随着菌丝生长，DivIVA 在菌丝尖端积累，而 FtsZ 则在横隔处形成分散的环状结构。
接下来，换用耗尽的培养基。这种培养基中缺乏营养物质，有利于孢子形成。
在萌发的菌丝中，DivIVA 焦点消失，FtsZ 重组为规则的分裂环 ladder 结构，形成孢子形成隔膜。
随着时间的推移，同一菌丝中 FtsZ 荧光的消失证实了孢子形成过程的完成。
提前将环境室预热至 30 摄氏度。
然后打开显微镜及显微镜控制软件。安装高数值孔径的油浸物镜，并确认用于获取微分干涉差（DIC）图像的相应滤光片和示意图镜已就位，同时确认用于获取黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白融合图像的滤光组件也已正确设置。在物镜上滴加一滴浸油，同时在微流控板成像窗口的底部也滴加浸油。
小心地将密封的微流控装置安装到倒置显微镜的载物台上并固定到位。利用内置的位置标记，使微流控培养腔的成像窗口处于焦点位置。首先对准标记为 A 的第一个流道最左侧部分，然后移动载物台至第五个捕获区域，对应捕获高度为 0.7 微米。
在微流控软件中，将系统设置为从入口孔八以 4 psi 压力加载细胞，持续 15 秒。运行过程结束后，通过移动载物台穿过成像窗口来检查培养室中的细胞密度。若未捕获孢子，需重复细胞加载步骤；或者，可提高加载压力和/或时间，直至达到每个成像窗口 1 至 10 个孢子的理想细胞密度。
注意避免过度加载培养室。接下来，在控制软件中启动先前准备好的流体程序，并在开始图像采集前，让微流控板在显微镜载物台上加热平衡一小时。在显微镜控制软件中，设置多维采集程序，通过首先指定图像文件自动保存的目录，实现随时间在多个载物台位置采集多幅图像。
接下来，进入照明设置，为每个特定的构建体输入预先确定的最佳照明参数。然后设置时间序列，以每40分钟采集一次图像，持续24小时。为了确定载物台位置并设置自动对焦，需扫描培养腔，并为每个感兴趣的成像位置保存载物台坐标。
确保单步位置之间的距离足够远，以尽量减少光漂白和光毒性。确认所选载物台位置的Z坐标后，启动硬件自动对焦功能，然后在显微镜控制软件中开始延时成像实验。
在24至30小时后或当目标区域的菌丝已分化为孢子时，停止图像采集。随后在软件中停止流体程序，并拆卸微流控装置。通过从进样孔、废液孔和细胞加样孔中移除残留培养基，对使用过的微流控板进行短期储存前的准备。
然后用无菌 PBS 补充加样通道 A 中已使用的孔以及未使用通道中的孔。最后，用封口膜密封培养板，防止其干燥，并将培养板置于 4°C 保存。