监测植物细胞中的细菌感染与效应蛋白递送

从一种实验植物开始，该植物的叶片区域经过基因改造，表达大型非荧光性的超级折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）片段。

用含有携带小的非荧光性sfGFP片段标记的效应蛋白的Pseudomonas细菌注射这些经修饰的区域。

孵育以促进细菌与叶片细胞之间的相互作用。

利用一种特殊的分泌系统，Pseudomonas 将带有标签的效应蛋白递送至叶片的细胞质中。

大片段与小片段GFP之间的邻近性使其能够组装成功能性的荧光sfGFP，随后转位至质膜。

孵育后，从注射区域切取叶盘。

使用激光扫描共聚焦显微镜观察这些圆盘。

首先以低激光强度对叶盘进行成像，以最小化自发荧光。然后提高激光功率以增强可见度。

绿色荧光证实了细菌成功侵染并将其效应蛋白递送至植物细胞内。

对于本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片，将假单胞菌（Pseudomonas）悬浮液注入两天前农杆菌（Agrobacterium）已侵染的相同区域。

最后，从叶片上切取一个叶圆片 假单胞菌接种的叶片。在接种假单胞菌后的特定时间点，使用共聚焦激光扫描显微系统对单株植物上两个面积为两平方厘米的叶片圆片进行成像。观察时应选择远离侵染孔的位置，以避免因机械损伤导致的死亡细胞干扰。

细菌转位的效应蛋白含量极低。因此，可适当提高激光功率并增强荧光发射，以检测荧光信号。但切勿过度增强，以免捕获植物细胞自发荧光产生的假信号。