采用糖醛酸咔唑法测定细菌海藻酸盐含量

取一份在肉汤培养基中的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）培养物。

将菌种接种于分离琼脂平板上，培养以促进细菌生长及藻酸盐的产生，藻酸盐是一种由糖醛酸组成的胞外多糖。

向细菌菌苔中加入等渗盐水，刮取以收集细菌细胞及藻酸盐。

将悬液转移至离心管中，涡旋振荡以充分分散内容物，并置于冰上以防止酶降解。

通过测量光密度（OD）来确定细菌密度。

将细菌悬液加入酸-硼酸盐溶液中，混匀以将海藻酸盐水解为尿酸单体。

加入咔唑，一种显色试剂，并进行孵育。在酸性条件下，该试剂与糖醛酸反应生成有色复合物。

测定吸光度以定量分析尿酸水平，该水平反映海藻酸盐浓度。

利用标准曲线确定海藻酸盐浓度，然后除以测得的细菌细胞密度，以计算单位生物量的海藻酸盐产量。

开始进行糖醛酸咔唑测定实验时，从待测目标菌株的纯培养物中选取一个单菌落，并使用无菌牙签挑取该菌落。

将牙签放入含有 5 毫升 PIB 的培养试管中，在 37 摄氏度的摇床培养箱中培养 24 小时。培养结束后，取适量培养后的 PIB 肉汤接种至预热的 PIA 平板上。

使用无菌细胞涂布器将肉汤在平板上涂布均匀，并在37摄氏度下培养24小时。使用移液控制器和无菌50毫升移液管，向已长好的菌苔中加入0.85%氯化钠溶液，并用细胞涂布器刮取平板上的菌落以收集样品。用一支新的50毫升移液管吸取样品，转移至50毫升收集管中。

将样品高速涡旋振荡以混匀，并将样品置于冰上。测量样品的OD 600时，首先使用1 mL 0.85%氯化钠溶液作为空白对照校准分光光度计。然后取1 mL样品加入新的一次性比色皿中，读取OD值。对每个样品重复此步骤两次，以获得三份读数。

现在向培养管中加入三毫升硫酸硼酸溶液，并置于冰上静置。将350微升收集的样品缓慢加入试管中的酸混合物中。在低速短暂涡旋振荡后，向酸性样品混合物中加入100微升0.1%咔唑乙醇溶液。

盖上管盖，中速涡旋振荡5秒。随后置于55摄氏度的干浴器中孵育30分钟。孵育结束后，高速短暂涡旋振荡各管，室温静置冷却5分钟。

使用含有 0.85% 氯化钠的试管作为空白对照，校准分光光度计。然后取 1 毫升混合液加入洁净的比色皿中，在分光光度计上测定样品在 530 纳米处的吸光度（OD）。通过测定已知浓度的 D-甘露糖醛酸系列稀释液在 530 纳米处的吸光度（OD 530），绘制标准曲线。

重复两次，根据这些读数拟合线性方程。利用标准曲线计算各样品中海藻酸盐的浓度，并将线性方程所得海藻酸盐浓度除以OD600，得到每单位OD600的海藻酸盐总量。