利用显微注射将细菌定位于斑马鱼幼鱼肠道腔内的递送方法

取一个培养皿，其中含有已麻醉的斑马鱼幼鱼。

在幼虫上方滴加一滴低熔点琼脂糖，轻轻将其侧向定位，以便在注射过程中暴露肠道。

现在，短暂冷却琼脂糖以使其凝固，从而固定幼虫。

加入含有麻醉剂的培养基，以维持幼虫处于麻醉状态。

接下来，取一悬液，其中含有荧光标记的Clostridioides difficile（一种致病性细菌），并加入示踪染料以方便监测注射过程。

将该混合物装入显微注射针中，并将针固定在显微操作器上。

在体视显微镜下，将针头以朝向幼虫肠道的角度定位。

然后，将针尖轻柔地插入肠腔内。

将细菌直接注入管腔，并使用示踪染料确认递送成功。然后，撤回针头。

利用荧光显微镜确认 Clostridioides difficile 在幼虫肠道中的定位。

首先，在培养皿中的斑马鱼幼鱼上滴加一滴 0.8% 的低熔点琼脂糖，使其完全覆盖。轻轻将幼鱼调整至侧卧位置。将培养皿置于冰上 30 至 60 秒，使低熔点琼脂糖凝固。

加入含 0.02% 至 0.04% 三卡因的 30% Danieau 培养基，以覆盖琼脂糖。为制备注射液，将 1 微升含 0.5% 酚红的 PBS 溶液加入 9 微升染色的 Clostridioides difficile 接种物中。使用 Microloader 将注射液吸入校准过的显微注射针中。

将装有样品的针头安装到显微操作仪上，并置于体视显微镜下定位。调节注射压力至600至900百帕之间。设定注射时间为0.1至0.3秒，以获得0.5至1.0纳升的注射体积。

将显微操作仪上的针头调整至大约 45 度角，指向包埋的幼虫。将针尖置于消化道上方，靠近泌尿生殖孔的位置。用针尖刺穿琼脂糖，然后刺入肌肉。

然后将其插入肠腔，并注射 0.5 至 1.0 纳升的 Clostridioides difficile。使用荧光显微镜监测注射后的幼虫，并用灵活的 Microloader 吸头挑取正确注射的幼虫用于共聚焦成像。