制备生物发光的肠出血性 Escherichia coli 接种物

从一管冻存的肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）开始，这是一种致病性肠道细菌。

这些细菌携带一种质粒，该质粒表达荧光素酶以用于实时生物发光成像，并携带一种抗生素抗性基因以用于筛选。

将细菌划线接种到含有适当抗生素的琼脂平板上，培养以分离出单个含质粒的菌落。

挑取单个菌落，并在添加抗生素的肉汤培养基中进行培养。孵育以扩增出基因均一且质粒稳定的菌群。

在通气条件下扩大培养，以使细胞同步处于对数生长期。

监测细菌生长，直至达到所需光密度。

接下来，离心培养物以沉淀细菌。

移去上清液，并用无菌生理盐水洗涤沉淀物。

再次离心。弃去上清液，将沉淀物重悬于较小体积的生理盐水中。

这种浓缩的EHEC悬液现已可用于基于生物发光的追踪。

首先，将含有荧光素酶质粒的 E.coli O157 H7 EDL933 细菌的负80摄氏度保存菌种在含50微克/毫升卡那霉素的LB琼脂平板上划线。在37摄氏度下培养细菌16至18小时。从过夜培养的平板上挑取单个菌落，接种至3毫升含50微克/毫升卡那霉素的LB培养基中。

然后，在 37 °C、220 rpm 条件下培养该菌液 16 至 18 小时。次日，取 2 毫升过夜培养物按 1:100 比例稀释，接种至含卡那霉素的 200 毫升 LB 培养基中。在 37 °C、200 rpm 条件下培养菌液 2.5 至 3 小时，或直至 600 纳米处的光密度值达到 0.9 至 1.0 之间。

接下来，将重新培养的细菌在8000 × g、4 °C条件下离心30分钟。弃去上清液，注意不要扰动沉淀，然后用100 mL 0.9%无菌生理盐水轻轻振荡洗涤细菌。洗涤后，再次离心细菌培养物，并轻轻弃去上清液。

然后，使用0.9%无菌生理盐水将沉淀物浓缩100倍。