E. coli 原生质球的制备

取一管大肠杆菌（E. coli）培养物。

用新鲜培养基稀释菌液并进行培养，以促进细菌分裂。

接下来，将菌液稀释到含有细菌分裂抑制剂的培养基中，并进行孵育。

细菌持续生长但不分裂，形成细长的丝状体。

将培养物转移至新的离心管中，然后离心以沉淀菌丝并去除上清液。

用渗透压稳定剂洗涤沉淀，以防止球状体裂解。移除溶液。

依次加入缓冲液、溶菌酶、DNase 和螯合剂。孵育。

螯合剂会破坏丝状结构外膜的稳定性。

溶菌酶降解暴露的肽聚糖层，导致丝状体失去原有形态并形成称为球状体的球形结构。

此外，DNase 可降解从受损菌丝中释放出的污染性 DNA。

再次加入渗透压稳定剂，混匀并孵育。

将悬液转移至含有缓冲液的离心管中，并进行离心。

去除多余的上清液，并将原生质球重悬于缓冲液中，用于后续分析。

为制备过夜培养物，使用无菌移液吸头从固体琼脂培养平板上挑取单个细菌菌落，转移至含有 2 至 3 毫升 3% 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的 14 毫升培养管中，在 37 摄氏度下振荡培养 16 至 21 小时。为制备革兰氏阴性 E. coli 原生质球，将过夜培养物按 1:100 的比例稀释，并加入 25 毫升 TSB 至 250 毫升三角瓶中，再将细菌放回摇床培养箱中继续培养 2.5 小时。当溶液在 600 纳米处的光密度达到 0.5 至 0.8 时，将培养物在新的 250 毫升三角瓶中按 1:10 的比例稀释于新鲜 TSB 中，进行第二次 2.5 小时的培养，最终头孢氨苄的终浓度为 60 微克/毫升。

在1000倍光学显微镜下观察，可获得长度约为50至150微米的单细胞丝状体。离心细菌溶液以收集丝状体，并倾去上清液。轻轻加入1毫升0.8摩尔蔗糖溶液洗涤丝状体，注意不要扰动沉淀。

一分钟后，弃去上清液，注意不要扰动沉淀，然后按相应顺序向纤维中加入指定的试剂。室温孵育十分钟后，在一分钟内逐渐加入一毫升溶液A，同时用手轻轻旋转混匀。室温孵育四分钟后，将纤维悬液均分为两份，分别加入两个含有七毫升4°C溶液B的15毫升锥形管中。接下来，通过离心收集纤维沉淀，并使用血清移液管小心吸除上清液，仅保留一至二毫升上清液，注意不要扰动沉淀。

使用 p1000 微量移液器轻轻重悬沉淀。通过光学显微镜检查样品的小份 aliquot 以确认原生质球的形成。原生质球可在 -20 摄氏度下保存长达一周，或直至经历三次冻融循环。