0 次观看 • 2:43 分钟 • September 26th, 2025
从诱导应激前后获得的细菌培养物的放射性标记核苷酸提取物开始。
在胁迫条件下，细菌酶将三磷酸鸟苷和二磷酸鸟苷转化为胁迫诱导型核苷酸五磷酸鸟苷和四磷酸鸟苷。
将提取物点样到预涂有阳离子聚合物作为固定相的薄层色谱板上。
将板放入含有缓冲液作为流动相的展开 chamber 中，确保液面低于样品点，以防止过早扩散。
让缓冲液通过毛细作用上升，根据核苷酸所带电荷和大小的不同，将其分离成不同的条带。
显影后，取出培养板，风干，并剪去顶部以去除游离同位素并降低背景信号。
将平板暴露于辐射敏感屏上以检测放射性信号。
应激诱导后，四磷酸鸟苷和五磷酸鸟苷水平升高，表明鸟苷酸池发生了动态变化。
首先，准备一块 20 × 20 厘米的 PEI 纤维素薄层色谱板。
使用剪刀剪去顶端五厘米，并用软铅笔在距边缘一厘米处画一条起始线。将每个样品五微升（5 µL）的液滴点在PEI表面。
在斑点干燥之前，将层析板转移至含有1.5摩尔磷酸二氢钾溶液的层析缸中，液层应足够浅，以免接触点样原点。用密闭盖子密封层析缸，使液体上升至15厘米裁剪后的层析纸顶端。完成后，取出充分展开的层析图谱，在室温下空气中干燥。
将含有游离P32的色谱图顶部切下并丢弃至放射性废物中。使用磷屏使放射自显影胶片过夜曝光。次日，显影胶片，并使用磷屏成像仪捕获并定量磷屏的绿色信号。
然后，使用 ImageJ 软件对放射性信号点进行定量分析。