在细菌宿主中扩增自杀质粒

从细菌沉淀开始。这些细菌含有编码起始蛋白的基因，但缺乏抗生素抗性基因。

将沉淀重悬于预冷的水中，以尽量减少细胞降解。

取一个携带抗生素抗性基因和目标基因的质粒。该质粒被称为自杀质粒，因为它在缺乏起始蛋白的情况下无法复制。

将质粒加入细菌悬液中。

将悬浮液转移至预冷的比色皿中。

通过施加高压脉冲，瞬时破坏细菌膜，使质粒进入，从而启动电穿孔。

加入恢复培养基，并将混合物转移至培养管中。

振荡孵育。

取含有抗生素的琼脂平板，并将菌液涂布于平板上。

细菌起始蛋白结合到复制起点，使质粒能够复制并表达一种抗生素抗性蛋白。

这使得含有质粒的细菌能够存活并生长，从而促进质粒的扩增。

将细菌培养物在 5,000 × g 和 4 °C 条件下离心 15 分钟，使菌体沉淀。用预冷的蒸馏水重悬沉淀，并重复洗涤过程两次。

将细菌悬液转移至微量离心管中，在14,000 × g、4 °C条件下离心5分钟。用预冷的水重悬沉淀后，加入约3.5 µL连接反应混合物，冰上孵育5分钟。将混合物转移至预冷的2 mm间隙电穿孔比色皿中。

电穿孔后加入SOC培养基，并将内容物转移至培养管中。在30°C、200 RPM振荡条件下孵育1小时。将转化后的细胞涂布于添加氯霉素的LB琼脂平板上。