分离含有基因组转座子插入的革兰氏阴性菌

首先将冰上冻存的革兰氏阴性细菌供体与受体交配后菌种在冰上解冻。

受体细胞携带转座子，即包含卡那霉素抗生素抗性基因的短DNA片段。这些转座子会随机整合到宿主基因组中。

将培养物接种至含有卡那霉素但不含供体特异性营养物质的营养丰富的琼脂平板上。

加入无菌珠，轻轻旋转培养板以均匀分散培养物。

去除磁珠并进行孵育。受体细菌可利用营养物质，但只有那些整合了转座子的细菌才能抵抗卡那霉素，从而形成菌落。

不含转座子的供体和受体细菌无法生长。

计数菌落形成单位，以估算含有独特转座子插入的受体细菌数量。

加入新鲜培养基并收集菌体。

离心以沉淀细菌，并弃去上清液。

用含有冷冻保护剂的培养基重悬菌体沉淀，以维持细菌的活性。

将一份冷冻的交配液在冰上解冻。然后，用无菌玻璃珠将150微升的稀释液均匀涂布于每个30毫米×150毫米的含卡那霉素的LB琼脂平板上。

处理含有过量交配菌液的废弃离心管，并将平板置于37°C培养14小时。培养结束后，计数每个平板上的菌落形成单位，以估算转座子文库中的总突变体数量。至少选取三个平板，计数其20%的菌落，以此推算所有平板的菌落总数。

在计算出估计的菌落产量后，向每个平板中加入三到五毫升 LB 培养基，使用无菌刮菌工具刮下细菌。将所有平板中的菌液收集至 50 毫升锥形管中，于 5,000 × g 离心 7 分钟，使菌体沉淀。弃去上清液，并将沉淀物重悬于 5 毫升含有 30% 甘油的 LB 培养基中。

然后，将转座子文库以每管1毫升分装至冻存管中，并于-80摄氏度保存。