Name: 从原核文化精简纯化的质粒DNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学习从大肠杆菌培养物中高效纯化质粒DNA的精简方法，利用AcroPrep Advance滤板进行裂解液澄清和DNA结合纯化。该方法可显著提高DNA产量并降低成本，适用于分子生物学和遗传学研究。

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1. 裂解液澄清
<ol>
 <li>在含有适当抗生素的LB培养基中，于37 °C、摇床条件下，过夜培养接种了目标质粒DNA的E. coli菌液（每孔1 mL），培养于深孔板中。</li>
 <li>在5,000 × g条件下离心培养板中的E. coli 10分钟，弃上清液。</li>
 <li>用100 μL重悬缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM EDTA，100 μg/mL RNase A）重悬每个菌体沉淀。</li>
	<li>每孔加入100 μL裂解缓冲液（200 mM NaOH，1% SDS），使用板式摇床震荡2分钟。</li>
 <li>每孔加入100 μL中和缓冲液（3.0 M醋酸钾，pH 5.5），震荡2分钟。</li>
	<li>将细胞裂解液转移至裂解液澄清板中。</li>
 <li>将DNA结合板置于350 μL收集板上方，并放入真空装置底部。组装真空装置（见图1）。</li>
	<li>将裂解液澄清板置于真空装置上方。</li>
 <li>在10 in. Hg（0.34 bar）真空度下抽滤，使滤液收集至DNA结合板中。切勿使用超过12 in. Hg（0.41 bar）的真空度。</li>
	<li>拆卸真空装置，将2 mL废液收集板置于装置底部。</li>
</ol>
2. DNA 结合
 <ol>
	<li>将DNA结合板移至多孔过滤装置顶部（见图2）。</li>
	<li>每孔加入300 μL结合缓冲液（6 M 盐酸胍），用移液器吹打混匀。</li>
	<li>施加真空（慢速抽滤时约为5 in. Hg（0.17 bar）），弃去滤液。此时DNA已结合至膜上。</li>
	<li>用洗涤缓冲液（80%乙醇）每孔400 μL进行洗涤。</li>
	<li>施加真空，然后弃去滤液。若使用2 mL收集板或将滤液直接抽入废液瓶，可丢弃收集板。</li>
	<li>重复洗涤一次。</li>
	<li>将滤板底部在吸水纸上轻压以干燥。</li>
	<li>再次施加真空5–10分钟，确保去除残留乙醇。</li>
	<li>再次轻压滤板底部，确保去除乙醇液滴。</li>
</ol>
3. DNA 洗脱
<ol>
	<li> 每孔加入 70 μL 洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM EDTA）。若需要更高的 DNA 浓度，可将体积减少至 50 μL/孔，但平均总得率会降低。</li>
	<li>在室温下孵育平板 1 分钟。</li>
	<li>可通过真空抽滤或离心法洗脱纯化的 DNA。</li>
	<li>真空法：将洁净的收集板（无 DNase、RNase）放入真空装置中。将滤膜板置于真空装置上方，以 15 in. Hg（0.5 bar）的真空压力抽滤 1 分钟，直至所有洗脱缓冲液完全通过 DNA 结合板。收集纯化的 DNA（见图 3）。</li>
	<li>离心法：将纯化滤膜板置于洁净的收集板上，以 1,000 × g 离心 5 分钟。</li>
</ol>
4. 定量与定性分析
<ol>
	<li> 测定OD260/280，计算纯化DNA的浓度。</li>
	<li>对纯化的质粒DNA进行琼脂糖凝胶分析。</li>
</ol>
5. 典型结果
采用传统离心法和 Pall AcroPrep Advance 裂解液澄清滤板对 E. coli 裂解液进行澄清后，起始材料中的碎片明显减少（图 4）。
将三种浓度的质粒DNA加入TE缓冲液中，并通过AcroPrep Advance裂解液澄清过滤板。过滤前后质粒DNA浓度的比较显示，在三种浓度下回收率均约为100%（图5）。
为证明从澄清的 E. coli 裂解液中回收 DNA 的效果，将质粒 DNA 加入粗裂解液中，随后通过过滤进行澄清；另将相同质粒 DNA 加入过滤后的细胞裂解液中作为对照。对各样品取等分试样进行电泳分析（图6）。各样品均显示出单一且强度相近的清晰条带，表明在基于过滤的澄清步骤中几乎未发生 DNA 损失。
使用 Pall 的 350 μL 和 1 mL DNA 结合滤板，以及另外两个品牌的 350 μL DNA 结合板，从含有 pCAT 质粒 DNA 的 E. coli 裂解液中纯化 E. coli 培养物。所有纯化步骤均按照制造商推荐的方案进行。其中，Pall 的 1 mL AcroPrep Advance DNA 纯化滤板获得了最高的 DNA 浓度和总得率（图 7 和表 2）。
尽管竞争者 W 的 DNA 浓度较高（155 ng/μL），但由于回收体积较低（约 30 μL），其总 DNA 产量最低，为 4.7 μg/孔。竞争者 M 的 DNA 浓度最低，为 108 ng/μL，总产量为 5.6 μg/孔。
图8显示了从三种不同DNA结合板纯化的pCAT DNA的琼脂糖凝胶分析结果。在电泳前，将每个收集到的样品体积调整至65 μL，以校正回收体积的差异。所有样品均显示出超螺旋质粒DNA，但每种滤膜板的DNA得率有所不同。
图9显示，制备的DNA均为超螺旋构型，且浓度相似。
<img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig1.jpg" alt="DNA纯化示意图；裂解液澄清、结合、废液收集板；实验室流程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 裂解液澄清用真空抽滤装置的组装。
<img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig2.jpg" alt="DNA 纯化装置；显示结合板和废液板的示意图；色谱应用。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. DNA 结合用真空抽滤装置的组装。
<img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig3.jpg" alt="DNA提取示意图；结合板、废液收集器、垫片、真空 manifold 组件。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 用于真空洗脱的真空 manifold 组装。
<img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig4.jpg" alt="显示OD320结果的柱状图：过滤前、过滤后、离心后，带有误差线。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 过滤简化了样品澄清过程。使用真空过滤（350 μL AcroPrep Advance 裂解液澄清过滤板）或传统离心法对300 μL粗裂解液进行澄清处理，每组三个重复样品。在澄清前后测定OD320。
<img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig5.jpg" alt="柱状图显示未过滤和过滤样品在 100、50、25 µg/mL 条件下的滤液浓度比较" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 图 5. pDNA 经 AcroPrep Advance 裂解液澄清滤板过滤后的完全回收。300 μL TE 缓冲液中添加 pCAT 至浓度为 25、50 和 100 μg/mL。根据过滤前后 OD260 测定 DNA 浓度并计算回收率，N = 2。
<img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig6.jpg" alt="凝胶电泳结果，DNA条带250-1500 bp，加标/澄清对比，分子分离。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 图6. 澄清后pCAT DNA的回收。在澄清前或澄清后向裂解液中加入等量pUC19，随后用TE缓冲液按1:10稀释。每孔上样2 μL，电泳于1.2%琼脂糖凝胶。
<img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig7.jpg" alt="比较Pall与竞争对手在每孔微克产量上表现的质粒DNA产量柱状图" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 图7. 使用Pall Acroprep Advance DNA结合滤板比竞争对手滤板每孔获得更高的质粒DNA产量。 使用指定的DNA纯化板从DH5α菌株的1 mL（Pall和竞争对手M）或1.5 mL（竞争对手W）过夜培养物中提取pCAT质粒DNA（OD260）。纯化操作按照各滤板制造商推荐的方案进行。误差线表示标准误差（n &gt; 6）。
<img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig8.jpg" alt="凝胶电泳结果；DNA条带、大小标记物、电泳比较，4000-1250 bp。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 8"> 图8. 在指定DNA结合板上纯化的pCAT DNA的琼脂糖凝胶分析。对纯化的质粒DNA进行1.2%琼脂糖凝胶电泳。样品来自三次独立纯化后的合并样本，纯化后洗脱液体积调整至65 μL，稀释1:10。每泳道上样2 μL。
<img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig9.jpg" alt="电泳结果；DNA条带分离；离心与真空法对比；标注片段大小。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图9"> 图9. 采用离心法或真空法进行最终洗脱液收集时，纯化DNA的质量与回收率相似：纯化pDNA的琼脂糖凝胶电泳结果。pDNA纯化按照AcroPrep Advance滤板制造商推荐的方案进行。洗脱步骤采用离心法（1,000 × g离心5分钟）或真空法（15 in. Hg（0.5 bar）下抽真空2分钟）。

本视频文章的作者均为 Pall Life Sciences 的员工，该公司生产本视频和文中所展示的仪器和试剂。

我们介绍一种简便且高效的 AcroPrep Advance 滤板操作流程，该方法具有多项优势。该方法在手动、半自动或全自动 AcroPrep Advance 操作模式下均能实现质粒 DNA 的最大得率。裂解液澄清板上集成的预滤膜可对样品进行稳定过滤，即使样品中含有较高含量的颗粒物亦能有效处理。板孔的几何结构使整块板的过滤速度更快、更均匀，且滞留体积最小；出口尖端的几何设计可使样品直接流入接收板，无需担心交叉污染。尤为重要的是，AcroPrep Advance 滤板中 DNA 结合板所采用的高结合容量膜经过优化，可最大限度回收高质量的质粒 DNA。

<table><tbody><tr><td>AcroPrep Advance 滤膜板</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8175 (1 mL) 或 PN 8075 (350 &amp;#181;l)</td><td>3 &amp;#x03BC;m 玻璃纤维，0.2 &amp;#x03BC;m Supor&amp;#174; 膜用于澄清</td></tr><tr><td>AcroPrep Advance 滤膜板</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8132</td><td>用于 DNA 结合</td></tr><tr><td>真空 manifold</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 5017</td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 13157</td><td></td></tr></tbody></table>

从原核培养物中简化质粒dna纯化流程

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

我们介绍了使用AcroPrep Advance滤板进行96孔质粒制备的完整流程，从原核生物培养开始，直至获得高纯度DNA。该方法基于多孔过滤技术，用于清除细菌裂解液并纯化DNA，从而实现质粒制备的高效流程化。含有硅基介质的滤板可通过真空过滤或离心方式轻松处理，获得较大量的质粒DNA。定量分析表明，纯化的质粒DNA质量稳定，平均OD260/280比值为1.97。总体而言，该方法获得的质粒产量更高、纯度更好，适用于测序、克隆等下游应用。使用AcroPrep Advance滤板的这一简化方法，可实现手动、半自动或全自动操作。

本方案为从大肠杆菌（E. coli）培养物中高效并行进行裂解液澄清和质粒DNA纯化提供了一种经济有效的替代方法。AcroPrep Advance工艺首先采用优化的裂解液澄清滤板，随后在高结合容量的DNA结合滤板上进行纯化。

从原核培养物中简化质粒DNA纯化流程

我们描述了使用AcroPrep Advance滤板进行96孔质粒制备的完整流程，从原核培养开始，直至获得高纯度质粒DNA结束。

streamlined-purification-of-plasmid-dna-from-prokaryotic-cultures

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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