Name: 一个负选择标记的发展阿米巴 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-12T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: 了解利用FCU1嵌合蛋白和5-氟胞嘧啶前药在溶组织内阿米巴中建立负选择系统的方法。该技术可选择性消除转染细胞，有助于基因破坏和毒力因子研究。

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我们感谢Philippe Erbs博士为我们提供了FCU1基因的序列。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目AI 26649的资助。

1. 溶组织内阿米巴中的 FCU 负筛选系统
<ol>
<li>对照组（HM1/pKT3M）和实验组（HM1/pKT3M-FCU1）通过先前描述的技术构建1,2。将待研究的细胞系从冻存管接种至T-25培养瓶中，并在TYI-S-333培养基中加入适当的抗生素（12 μg/mL G418）以维持筛选压力。在37°C培养16–18小时后，培养瓶中的细胞应达到70–80%融合度。</li>
<li>用温热的TYI-S-33培养基配制新鲜的50 mM 5-氟胞嘧啶（5-FC，Sigma）储备液。充分涡旋振荡数分钟，确保5-FC完全溶解。通过0.22 μm滤器过滤除菌储备液。</li>
<li>将培养瓶置于冰上3–5分钟以收获滋养体，随后在室温下以200×g离心5分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于新鲜TYI培养基中并进行细胞计数。</li>
<li>典型的实验设计为：在48孔板中每孔接种0.5 × 104个细胞，终体积为1 mL；每种实验条件设三个重复。此外，为便于进行荧光检测，每个菌株在每个时间点需使用单独的培养板。</li>
<li>针对每种测试的5-FC浓度，每孔接种0.5 × 104个细胞，设三个重复。在TYI培养基中维持抗生素筛选压力。随后向各孔中加入所需量的5-FC储备液和滋养体。</li>
<li>将培养板置于厌氧袋中，在37°C孵育。</li>
</ol>
2. 选择效率的测定
<ol>
<li>用DMSO配制2 mg/mL的Cell tracker green CMFDA（Invitrogen）储备液。将储备液用无血清TYI培养基稀释1000倍，制备工作液。</li>
<li>彻底移除滋养体培养板中的培养基，加入150 μL含CMFDA的无血清TYI培养基。在37°C继续孵育1小时。</li>
<li>移除染料溶液，使用Spectramax M2微孔板荧光分光光度计读取吸光值。激发波长设为492 nm，荧光发射波长设为517 nm。</li>
<li>比较对照细胞与待测转染细胞的荧光值。</li>
<li>在每个时间点继续读取微孔板数据。每块板均需设置适当的阳性对照（仅含TYI）和阴性对照（含25 μg/mL潮霉素）孔。</li>
</ol>

3. 代表性结果 
E. histolytica 转染子表现出对密码子优化的重组 FCU1 的高效表达（图1）。当正确执行本方案时，可在 0.5 mM 5-氟胞嘧啶存在条件下选择性清除表达 FCU1 的 E. histolytica 细胞。相比之下，对照细胞在高达 5 mM 的 5-FC 浓度下仍能正常生长，并在 72 至 96 小时之间达到汇合状态（图2-a）。在处理 48 小时后，显微镜下观察可见携带 FCU1 的细胞完全裂解。当使用活细胞染料 CMFDA 染色时，这些细胞的荧光信号也明显减弱，该染料常用于涉及大量样本的定量研究（图2-b）。FCU1/5-FC 系统是针对 E. histolytica 滋养体的一种高效且强大的负筛选工具。
<img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig1.jpg" alt="Western blot 和柱状图显示抗-Myc 蛋白表达及在 E. histolytica 转染子中标准化的 FCU1 表达。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 表达负向筛选标记的E. histolytica HM1 转染子的构建 
（a）使用抗-c Myc 抗体在 Western blot 上检测到 FCU1 重组蛋白（上图）。与预期一致，在 FCU 转染子的总裂解液中可检测到一条 42 kDa 的条带（箭头所示），而在仅含载体的对照转染子中则无法检测到。下图显示同一张膜使用抗肌动蛋白（actin）抗体进行探针杂交，作为上样对照。（b）定量实时 PCR 结果显示 FCU1 特异性 mRNA 的表达水平，已标准化至 lgl4 内参。

<img src="/files/ftp_upload/2410/2410fig2.jpg" alt="荧光分析图，显示实验研究中浓度对随时间变化的荧光强度的影响。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 体外 药物敏感性 E. histolytica 表达负筛选标记的转染子 
生存曲线的（a) 对照转染细胞和 (b) 表达FCU1的转染细胞培养于48孔板中。细胞在含递增浓度前药5-氟胞嘧啶的培养基中生长；在X轴所示各时间点，通过CMFDA染色定量细胞存活率。Y轴表示荧光强度单位，直接反映存活细胞数量。请注意，与对照组相比，表达FCU1的转染细胞在0.5 mM前药浓度下表现出显著敏感性。在显微镜下观察，这些孔中在120小时时间点未见细胞，而相应对照孔中可见融合生长（数据未显示）。Hygro表示 25μg/ mL 潮霉素用作阴性对照。

<ol><li>Olvera, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfection+of+Entamoeba+histolytica+trophozoites+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection.</a> Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).</li>
<li>Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5-associated+vacuoles+play+a+unique+role+in+phagocytosis+of+the+enteric+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).</li>
<li>Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+medium+for+the+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+and+other+Entamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Soc.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).</li>
<li>Clark, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+C+%22Anaerobic+parasitic+protozoa+%3A+genomics+and+molecular+biology%22">Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology</a>. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).</li>
<li>Linford, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA-mediated+knockdown+of+protein+expression+in+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica.</a> BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).</li>
<li>Solis, C. F., Guillén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+genes+by+RNA+interference+in+the+protozoan+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica.</a> Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).</li>
<li>Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacterially+expressed+dsRNA+to+downregulate+Entamoeba+histolytica+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression.</a> PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).</li>
<li>MacFarlane, R. C., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+dsRNA-based+gene+silencing+in+Entamoeba+histolytica%3A+implications+for+approaches+to+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis.</a> Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).</li>
<li>Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+DNA+fragments+enhance+the+stability+of+transfected+DNA+in+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Eukaryot.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica.</a> J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).</li>
<li>Erbs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cancer+gene+therapy+by+adenovirus-mediated+transfer+of+a+bifunctional+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyltransferase+fusion+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene.</a> Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).</li>
<li>Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+positive-negative+selectable+marker+system+for+use+in+reverse+genetics+in+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium.</a> Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).</li>
<li>Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+using+yeast+cytosine+deaminase%2Furacil+phosphoribosyl+transferase+in+Plasmodium+falciparum+for+targeted+gene+deletion+by+double+crossover+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).</li>
</ol>

本视频的制作由 Sigma Aldrich, Inc. 赞助，该公司生产了本文所使用的一些试剂。

尽管溶组织内阿米巴的分子生物学工具已取得显著进展，但目前尚无可用的方法来删除或破坏基因4。基因特异性表达的敲低已通过使用发夹RNA5、小干扰RNA6以及细菌表达的双链RNA7实现。然而，这些方法虽然对各自的目标基因有效，但仍存在若干局限性，包括需要使用昂贵的化学试剂、需持续进行抗生素筛选，以及由于随时间推移回复突变的发生率较高，需不断验证实验结果（Alicia Linford，个人交流）8。
任何质粒都可以在 溶组织内阿米巴 因为DNA复制起点显然没有严格的序列要求9，因此一旦转染，通常很难清除质粒。这限制了完整质粒在重组和基因敲除实验中的应用。负筛选标记是基因靶向方法中的关键组分，可用于消除重组亚群。我们已成功表达了密码子优化的FCU1基因 溶组织内阿米巴 并测试了其作为阴性筛选标记的潜力。该基因融合已被用于人类肿瘤细胞的自杀基因治疗，能够将前体药物5-FC代谢为有毒的下游产物，从而抑制RNA和DNA的合成10. FCU1 最近被用作负筛选标记 疟原虫另一种原生动物寄生虫。 疟原虫伯氏疟原虫 表达FCU1的细胞对前药的敏感性几乎提高了1000倍 体外 和 在体 在疟疾红细胞期小鼠模型中，5-FC处理杀灭了超过99.9%的感染性重组寄生虫11. E. histolytica 表达FCU1的细胞对前体药物5-FC的敏感性仅增加了30倍，与观察到的敏感性相比 P. berghei可能的原因是培养基中存在大量核苷酸，与有毒代谢物竞争。 
在两者中 P. berghei 和 P. falciparum FCU1 标记已用于靶向基因破坏研究。11,12我们旨在利用同源重组技术对溶组织内阿米巴基因组进行操作。FCU1/5-FC负筛选系统的验证是实现这一目标的重要步骤。

<table><tbody><tr><td>TYI-S-33 培养基</td><td>ATCC</td><td></td><td>文中已包含参考文献</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=F7129%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC">5-氟胞嘧啶&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7129</td><td></td></tr><tr><td>细胞追踪绿 CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max M2 酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

溶组织内阿米巴负筛选标记的开发

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica 是阿米巴病的致病原，可感染全球最多达10%的人口。目前用于上调和下调基因表达的分子技术依赖于稳定维持质粒的转染。尽管这些技术增进了我们对溶组织内阿米巴毒力因子的理解，但若能将外源DNA整合到基因组中，则将有利于开展反向遗传学实验，从而为该寄生虫的研究带来显著优势。然而，该生物体面临若干挑战，包括无法筛选同源重组事件，以及难以从转染的滋养体中彻底清除附加体质粒DNA。后者导致外源DNA背景水平较高，严重干扰了真正发生基因组整合事件的滋养体的鉴定。本文报道了一种基于转基因表达酵母胞嘧啶脱氨酶与尿嘧啶磷酸核糖转移酶嵌合蛋白（FCU1）并利用前药5-氟胞嘧啶（5-FC）进行筛选的阴性筛选系统。FCU1酶可将无毒性的5-FC转化为有毒的5-氟尿嘧啶和5-氟尿苷-5'-单磷酸。E. histolytica 表达FCU1的细胞系对前药的敏感性较对照菌株高出30倍。

我们报道了一种基于E. histolytica中转基因表达嵌合蛋白（FCU1）并利用前药5-氟胞嘧啶进行筛选的负筛选系统。FCU1蛋白是酵母胞嘧啶脱氨酶与尿嘧啶磷酸核糖基转移酶的融合蛋白。表达FCU1使E. histolytica对5-氟胞嘧啶的敏感性显著提高。

溶组织内阿米巴是阿米巴病的致病原，可感染全球最多达10%的人口。分子技术的发展使得……

本实验的总体目标是验证五氟胞嘧啶（5-FC）FCU1系统作为溶组织内阿米巴中负筛选方法的有效性。在48孔板中接种表达FCU1基因或相应空载体对照的溶组织内阿米巴转染株，用前药5-FC处理细胞。在高表达FCU1的细胞中，5-FC将被转化为足量的毒性终产物。通过C-M-F-D-A染色存活细胞群体，以证明在5-FC存在下特异性清除表达FCU1的细胞，并定量比较负筛选效率。该负筛选系统将使我们首次能够从转染的溶组织内阿米巴中彻底清除附加体质粒。鉴于传统基因操作在抗性存在下的困难，该方法可能使我们能够破坏并删除基因，进而用于药物发现项目中靶向VIR因子的功能验证。滋养体在不同批次培养物中的生长状况可能存在差异。初始阶段的任何误差都可能产生人为假象，因此，对起始培养物进行质量控制是一个关键的早期步骤。将正在研究的 inba hisa 菌株从冻存管接种至 T25 培养瓶中，并通过在 TYIS 33 培养基中加入适当的抗生素以维持筛选压力。将培养瓶置于 37°C 培养 16 小时，使细胞培养物达到约 80% 汇合度。在此操作过程中，始终需用温热的 TYIS 33 培养基 freshly 配制 50 毫摩尔的五氟尿嘧啶（5-fluorine 或 FC）储备液。剧烈涡旋振荡培养基数分钟，以彻底溶解五倍浓缩的FC，并通过0.22微米滤器过滤、灭菌，以收获滋养体。将培养瓶置于冰上3至5分钟，然后在室温下以200 × g离心5分钟收集细胞。将沉淀重悬于新鲜TYI培养基中，并计数细胞，以便后续进行荧光检测。 每个时间点每种菌株分别使用一块新的48孔板进行实验，每孔接种0.5 × 10⁴个细胞，体积为0.5毫升，每个测试设三个重复。五氟胞嘧啶（5 FC）浓度需保持，并在TYI培养基中维持抗生素选择压力。随后，向每孔中加入所需量的5 FC储备液，再加入TYI培养基至终体积为1毫升，将培养板置于厌氧袋中，在37°C下孵育。用DMSO配制浓度为2毫克/毫升的细胞示踪绿C-M-F-D-A储备液。然后在指定的实验时间点，将该储备液用无血清TYI培养基稀释1000倍，制成工作液。完全移除滋养体-包囊培养板中的培养基，并加入150微升含有C-M-F-D-A的无血清TYI培养基。在37摄氏度下继续孵育一小时，吸去各孔中的DI溶液。最后使用SpectraMax M2微孔板分光荧光计读取结果，激发波长为492纳米，发射荧光波长为517纳米。比较对照细胞与待测转染细胞的荧光值。在每个时间点继续读取酶标板。每次实验均需使用适当的阳性与阴性对照孔。Western BLO 分析表明，成功构建了表达 FCU1 的 lyase 转染子，该蛋白为酵母胞嘧啶脱氨酶与尿嘧啶磷酸核糖转移酶的融合蛋白。这些结果在定量 PCR 测量中也得到体现。在五氟对照细胞中，当浓度高达 5 毫摩尔/升时，细胞正常生长，并在 72 至 96 小时之间达到汇合状态。相比之下，在 0.5 毫摩尔/升前药存在下，表达 e histolytica 的 FCU1 细胞在明场显微镜下被选择性清除。表达FCU的溶组织内阿米巴细胞对五种FC Pro药物的选择性反应可通过细胞清除现象观察到。在此情况下，转染后72小时进行培养。进行该实验时，重要的是要记住在每个时间点都监测细胞生长情况。该方法可用于“命中即走”诱变，我们将利用该方法来回答有关尹巴氏志贺菌毒力的重要问题。

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