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微生物学
0 次观看 • 3:47 分钟 • October 30th, 2025
细菌膜结合型焦磷酸酶（mPPase）在跨膜转运钠离子的同时，将焦磷酸水解为正磷酸盐。
为了评估抑制剂对膜结合型焦磷酸酶（mPPases）的作用，向试管条中加入浓度递增的磷酸盐标准品。
将可能抑制mPPase的待测化合物加入试管中，留一管加入水作为对照。
除标准品管外，向所有试管中加入来源于嗜热菌 Thermotoga maritima 的脂质体包埋型mPPases。
密封并在最适温度下孵育，以激活酶。
加入焦磷酸钠以启动反应并释放正磷酸盐。
将试管转移至冷却平台以终止反应，并进行离心以去除冷凝液。
加入钼酸盐-抗坏血酸试剂，与正磷酸盐反应生成磷钼酸。
加入亚砷酸盐-柠檬酸盐溶液以还原酸，形成稳定的蓝色复合物。
将内容转移至多孔板并测定吸光度。
与对照组相比，较低的吸光度表明mPPase受到抑制，而标准品则作为磷酸盐定量的参考依据。
向10毫升溶液A中加入1毫升溶液B，手动混匀，并将溶液置于冰上保存。
使用多通道移液器，向三份试管中分别加入 40 微升浓度为 0、62.5、250 和 500 微摩尔的磷酸盐标准品。
然后，除含有磷酸盐标准品的试管外，向每根试管中加入 25 µL 化合物溶液和 15 µL mPPase 溶液混合物。用粘性封板膜密封试管条。裁剪封板膜以分离各试管条。
接下来，将样品在71摄氏度的加热块上预孵育5分钟，每条样品之间间隔20秒。
对于每一条试纸，打开粘性封膜。使用多通道移液器加入10 µL的2 mM焦磷酸钠二碱，并通过上下吹打5次进行混匀。
使用相同的封口方式再次密封试管条。
再次在71摄氏度孵育五分钟。随后，将样品以每条间隔20秒的节奏放置于冷却装置上。
静置5分钟使其冷却，然后短暂离心每个条带，使封膜下的水滴沉降至底部。将条带放回冷却装置，移除封膜，再冷却5分钟。随后，加入60微升溶液A和B，用移液器上下吹打5次混匀，并将条带继续置于冷却装置中反应10分钟。
在通风橱中，加入 90 微升亚砷酸盐柠檬酸溶液，并在室温下静置至少 30 分钟，以生成稳定的蓝色。将每种反应混合物各 180 微升分装至透明的 96 孔聚苯乙烯微孔板中。使用微孔板分光光度计在 860 纳米波长处测定每个孔的吸光度。