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取含有亲水性蛋白质、脂蛋白和蛋白质聚集体的细菌裂解液。
加入一种在较高温度下能够发生相分离的冷态非离子型去污剂。
冰上孵育,并定期混匀。去垢剂会结合脂蛋白的脂质部分,形成蛋白质-去垢剂复合物。
加热混合物以诱导相分离。脂蛋白富集于去垢剂相中,而亲水性蛋白质则保留在水相中。
在室温下离心,以维持两相分离状态。
弃去水相,向去垢剂相中加入冷缓冲液并混匀。
重复冷却、复温及离心循环,以富集脂蛋白。
然后,加入冷缓冲液并在低温下离心,以沉淀非脂蛋白聚集体。
将上清液转移至含有蛋白质沉淀溶剂的离心管中,并在零下温度下孵育,以沉淀脂蛋白。
在室温下离心,并弃去上清液。
沉淀的脂蛋白可用于后续研究。
向离心上清液中加入冰冻的4% TX-114表面活性剂溶液,使终浓度为2%(加入体积与上清液体积相等)。将添加了表面活性剂的上清液置于冰上孵育1小时,每15分钟颠倒混匀一次。随后将离心管转移至37摄氏度水浴中,孵育10分钟以诱导相分离。
在室温下以10,000 × g离心样品10分钟,以维持两相分离。小心吸取上层水相并弃去。向下层表面活性剂相中加入预冷的TBSE,补足至原体积,倒置混匀。
冰上孵育10分钟。孵育结束后,将离心管转移至37摄氏度水浴中孵育10分钟以诱导相分离,然后在室温下以10,000 × g离心10分钟。重复上述步骤一次,共进行三次分离,之后移除上层水相并弃去。
向表面活性剂相中加入一体积预冷的冰TBSE,以去除提取过程中形成的沉淀蛋白质颗粒。在4摄氏度、16,000 ×g 条件下离心2分钟,使不溶性蛋白质沉淀。立即将上清液转移至含有1,250微升100%丙酮的新的2.0毫升微量离心管中。
通过倒置混匀样品,并在 -20 摄氏度下孵育过夜以沉淀蛋白质。次日,在室温下以 16,000 × g 离心 20 分钟,使脂蛋白形成沉淀,注意离心管的方向。用 100% 丙酮洗涤沉淀物两次,然后倾去丙酮,让样品自然风干。
然后,加入 20 至 40 微升 10 毫摩尔/升 Tris-HCl(pH 8.0),并用移液器反复吹打管壁,使沉淀的脂蛋白充分重悬。