为什么凝胶过滤层析对诺如病毒P结构域的纯化至关重要？

根据大小将目标P结构域与杂质分离，从而纯化出正确折叠的二聚体，用于结构与功能研究。

在色谱过程中，缓冲液平衡如何维持蛋白质的完整性？

平衡过程通过在整个分离过程中提供一致的物理化学环境，维持P结构域的结构稳定性。

洗脱过程中紫外吸收监测揭示了什么信息？

紫外吸收检测蛋白质洗脱峰，吸收值上升表明P结构域释放，而较早出现的小峰显示杂质的洗脱。

洗脱后为何必须进行分级分离和收集？

收集1.5 mL的组分可分离出通常以二聚体形式洗脱的P结构域峰，用于后续分析。

SDS-PAGE 如何确认纯化是否成功？

通过显示P结构域条带及无污染蛋白的存在，洗脱组分的SDS-PAGE分析验证了纯度。

人诺如病毒细菌来源重组P结构域蛋白的纯化

JoVE Encyclopedia of Experiments

微生物学

0 次观看 • 2:01 分钟 • October 30th, 2025

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取一根装有孔状球形凝胶珠的尺寸排阻色谱柱。

使用缓冲液平衡层析柱，以在分离过程中维持蛋白质的结构完整性。

加入含有重组表达的人类诺如病毒P结构域蛋白及残留蛋白杂质的纯化细菌提取物。

加入缓冲液以推动样品流经层析柱。

较大的残留杂质无法进入孔隙，也不能通过珠粒之间的空隙，因此最先被洗脱出来。

使用紫外吸收监测洗脱过程。小峰表明杂质正在流出层析柱。

相比之下，较小的P结构域蛋白能够进入微珠孔隙，经历更长的路径，较晚洗脱。吸光度峰的升高表明P结构域蛋白的洗脱。

收集含有P结构域蛋白的洗脱组分，这些组分现已可用于进一步分析。

清洗高效液相色谱纯化系统的泵和管路，并用凝胶过滤缓冲液预先平衡尺寸排阻色谱柱。根据浓缩样品的体积，使用超大进样环或进样环，以每分钟1毫升的流速将P结构域注入色谱柱。进样完成后，将流速提高至每分钟2.5毫升。

随着光密度的增加，P结构域将从层析柱中洗脱出来，此时收集每份1.5毫升的组分。P结构域通常以二聚体形式洗脱。