一种从Streptococcus mutans中纯化多聚组氨酸标签蛋白的实验方法

取一培养物 Streptococcus mutans 表达带有聚组氨酸标签并分泌到培养基中的蛋白质。

离心培养物并收集富含蛋白质的上清液。

加入硫酸铵，搅拌孵育，通过降低蛋白质的溶解度使其沉淀。

将溶液转移至离心管中，离心后弃去上清液。

用含有盐和低浓度咪唑的结合缓冲液重悬沉淀，以稳定蛋白质。

用新鲜的结合缓冲液透析溶液，以去除过量的盐。

离心透析后的溶液以沉淀不溶性杂质，然后过滤上清液。

将滤液与负载镍离子的亲和树脂混合，孵育以使带有多聚组氨酸标签的蛋白质选择性结合到镍离子上。

将混合物上样至层析柱，并用结合缓冲液洗涤以去除未结合的蛋白质。

接下来，加入含有高浓度咪唑的洗脱缓冲液，以置换组氨酸与镍离子的结合，从而释放带有聚组氨酸标签的蛋白质。

收集含有纯化蛋白质的洗脱液。

在4°C条件下，以10,000 × g离心细菌培养悬浮液20分钟。

将培养上清液转移至一个三升的玻璃烧杯中。为浓缩培养上清液中的蛋白质，将两升上清液置于磁力搅拌器上，开始剧烈搅拌。加入1,122克硫酸铵，在4°C下剧烈搅拌4小时或过夜，使沉淀形成。

接下来，在 4°C 条件下，以 15,000 × g 离心硫酸铵沉淀溶液 20 分钟。倾去上清液。用刮勺收集沉淀物，并转移至一个 200 毫升的玻璃烧杯中。

将沉淀重悬于35毫升结合缓冲液中。然后，将每份约25毫升的悬液转移至再生纤维素透析管中。将透析管置于2.5升4°C的搅拌结合缓冲液中，在搅拌器上透析悬液。

两小时后更换透析液，并继续透析过夜。接着，将透析后的悬液从透析管转移至离心管中，于4°C、20,000 × g 离心10分钟。使用抽滤装置，将上清液倒入0.2微米孔径的膜滤器中进行过滤。

将滤液转移至75毫升的烧瓶中。

为了从滤过的悬浮液中分离带有聚组氨酸标签的 gtfSI，首先准备固定化金属亲和层析柱。按照手稿中的说明平衡树脂后，关闭霍夫曼夹。

将5毫升过滤后的悬浮液加入柱中，制成浆液。然后，将全部浆液转移至剩余的过滤后悬浮液中，在4摄氏度下轻轻摇动混合物30分钟。将混合液重新加载到柱中。

打开霍夫曼夹管，通过重力流去除悬浮液。用 20 毫升结合缓冲液洗涤 IMAC 树脂，然后加入 20 毫升洗脱缓冲液以获得重组 gtfSI。