微流控延时显微技术研究细菌对抗生素的持留现象

从表达荧光标记的DNA结合融合蛋白的指数生长期细菌细胞开始，以观察拟核结构。

将细胞加入预先准备好的微流控板的细胞加样口。

接下来，将含抗生素的培养基和不含抗生素的培养基分别引入不同的溶液入口。

密封培养板，将其安装到显微镜载物台上，并开始延时成像。

首先，将细胞加入培养室中。

然后，将不含抗生素的培养基灌注到腔室中，以支持细胞的指数生长。

最后，加入含有抗生素的培养基。

该抗生素可诱导DNA双链断裂，从而杀死敏感细胞。这些细胞表现出紧缩、不复制的拟核结构，并具有稳定的荧光。

换用不含抗生素的培养基以促进恢复。

持留细胞——一种能够在抗生素治疗中存活的小亚群细胞——会恢复 DNA 复制，伸长并分裂。

这种恢复导致持留细胞的荧光增强，使其能够与敏感细胞在视觉上区分开来。

从微流控板的每个孔中移除保存液，并替换为新鲜的培养基。通过点击密封按钮或使用微流控软件，利用管路系统对微流控板进行密封。

接下来，在微流控软件界面上，单击“运行液体引灌序列”执行第一次引灌程序。在开始显微成像之前，将芯片置于显微镜的恒温控制箱中，于37摄氏度孵育至少两小时。然后在开始实验前，再次执行第二次“运行液体引灌序列”。

通过点击微流控软件界面上的“Unseal Plate”来密封微流控板。将孔中的培养基更换为200 µL新鲜培养基、含抗生素的新鲜培养基，以及用新鲜培养基稀释至0.01 OD的培养样品。按照之前演示的方法密封微流控板后，将该板放置于显微镜柜内显微镜物镜上。

在微流控软件中，单击“运行细胞加载序列”，以将细胞加载至微流控板中。使用透射光模式设置最佳焦距，并选择多个感兴趣区域，使每个视野中可观察到最多约 300 个细胞。在微流控软件中，编辑“运行自定义序列”，以编程方式向第一和第二孔注入压力为 6.9 千帕的新鲜培养基，持续六小时；随后向第三孔注入含抗生素的培养基，压力为 6.9 千帕，持续六小时；最后向第四和第五孔注入新鲜培养基，压力为 6.9 千帕，持续 24 小时。

使用透射光和荧光报告基因的激发光源，以每15分钟一帧的频率进行延时模式显微成像，并启动微流控程序。在计算机上打开ImageJ或Fiji软件，将多通道延时显微图像拖入Fiji的加载栏中。依次选择图像（Image）、颜色（Color），然后选择合成图像（Make Composite），以融合多通道图像中的不同通道。

如果通道与所需颜色不对应，请使用图像、颜色，然后排列通道。打开 MicrobeJ 插件，使用手动编辑界面检测细菌细胞。删除自动检测到的细胞，并逐帧手动勾勒出感兴趣的持留细胞。

检测完成后，使用 MicrobeJ 手动编辑界面中的“结果”图标生成 ResultJ 表格。利用 ResultJ 表格获取单细胞分析中不同感兴趣参数的信息，并保存 ResultJ 文件。