0 次观看 • 3:15 分钟 • October 30th, 2025
取一个含有多孔板，其中培养了经不同测试化合物处理的基因修饰致病菌，同时包括阴性对照。
这些细菌携带一种质粒，该质粒含有编码绿色荧光蛋白（GFP）的基因。
该基因的启动子由一种响应细胞内环二鸟苷酸（c-di-GMP）浓度的蛋白质激活。
将培养板放入酶标仪中。
使用阴性对照进行设置调整，以获得最佳的荧光信号检测效果，阴性对照因不存在 c-di-GMP 抑制剂而表现出最强的荧光。
如果待测化合物抑制 c-di-GMP 的形成，则细胞内 c-di-GMP 水平会降低。
c-di-GMP 水平降低会引发蛋白质发生构象变化，导致启动子被抑制和GFP表达降低，从而引起荧光减弱。
检测荧光并分析数据，以鉴定可调节致病菌细胞内 c-di-GMP 水平的测试化合物。
在进行分光光度测量前约30分钟，将酶标仪预热至37摄氏度，以避免产生冷凝。读板前轻轻移除板上的透气封膜。
然后，在600纳米波长下测量光密度，设定每孔10次闪光，平衡时间为0.2秒。在测量荧光之前，根据阴性对照孔A24进行自动增益和焦距调整，并将增益目标值设定为75%。
在窗口右侧选择焦距调节和通道A。设置每孔10次闪光，静置时间为0.2秒，于485纳米激发波长和520纳米发射波长下测量GFP报告基因的荧光。
收集所检查的所有板的数据。数据读数将由板式读数仪控制软件自动默认保存。
为分析数据，请在控制软件中点击火星图标以打开统计分析软件包来查看读数。通过双击感兴趣的板编号，可调取相应数据进行分析。
使用稳健的Z'因子分析评估该检测方法的均一性和可重复性。
然后，计算生长抑制百分率，并按照文本方案中所述评估细胞内 c-di-GMP 水平的抑制百分率。