Bacillus subtilis 芽孢的制备与基于气溶胶的沉积

以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）培养物开始，这是一种具有高度抗性的产孢细菌。

将培养物接种到营养受限的培养基中，并在通气条件下培养以诱导孢子形成。

产孢细胞产生具有保护层的休眠孢子。

将培养物转移至离心管中，离心以沉淀孢子。弃去含有残留细胞和碎片的上清液。

用无菌蒸馏水洗涤沉淀物，重复离心，并将孢子重悬于无菌水中。

使用相差显微镜，通过识别明亮的孢子并确认无污染物存在，来验证孢子纯度。

对孢子进行连续稀释，涂布于营养琼脂平板上，培养以使有活力的孢子萌发形成菌落。通过计数菌落确定孢子浓度。

根据此浓度，调整孢子用量，并将稀释后的样品加入气溶胶喷嘴中。将其喷洒至无菌玻璃表面，悬液会迅速干燥，形成一层薄而均匀的孢子单层。

为进行孢子生产，将5毫升添加了适当抗生素的相应 B. subtilis 菌株过夜培养物转移至200毫升双倍浓度的液体Schaeffer孢子形成培养基中，在37摄氏度下充分通气培养至少72小时或更长时间，直至超过95%的培养物形成孢子。将孢子在15毫升离心管中以3000 ×g离心15分钟收集，并使用无菌蒸馏H₂O通过多次洗涤步骤纯化样品。

通过相差显微镜检查纯度和萌发状态，确保孢子悬液中相亮孢子比例超过99%，且无营养细胞、已萌发孢子及细胞碎片，否则可能干扰后续显微镜实验。通过将10倍系列稀释的50微升样品涂布于LB琼脂平板，计算CFU，并将平板在37摄氏度下过夜培养，以测定孢子滴度。在确定CFU后，通过浓缩或使用无菌水稀释样品，将样品调整至每毫升10 的9次方孢子。

将无菌的显微镜载玻片或直径为25毫米的圆形盖玻片形式的样品载体放入电动气溶胶喷雾装置中，使其与喷嘴对齐。将孢子培养物转移至喷嘴液体入口，并在0.15秒时以1.3 bar的压力启动喷雾。喷出的孢子悬浮液在显微镜载玻片上形成一层薄膜，数秒内迅速干燥，形成均匀分布的单层孢子。将处理后的样品载体置于室温下的无菌容器中保存。