果蝇肠道相关细菌菌落形成单位的定量分析

从含有黑腹果蝇（Drosophila）组织匀浆的微孔板开始。这些果蝇肠道内定植有受控数量的特定细菌。

匀浆中含有裂解的果蝇组织和释放的肠道细菌。

吸弃悬浮的细菌，并在多个微孔板中进行连续梯度稀释。

将每个稀释液的小体积样品点样到琼脂平板上，确保液滴保持分离。

孵育以使细菌增殖形成可见的菌落。

拍摄平板图像以定量菌落形成单位（CFUs），该数值代表能够形成单个菌落的活菌细胞数量。

使用图像分析软件，通过参考线对齐每幅图像，定义边界，并应用统一的网格将其分割为计数区域，每个区域对应一个单独的点。

调整亮度阈值以区分单个菌落与背景，然后运行分析以计数每个区域中的菌落并定量CFU。

在生物安全柜中放置三个矩形MRS琼脂培养板，打开盖子至少干燥10分钟。使用96通道移液器，向无菌96孔板的每个孔中加入100 µL PBS，制备两个稀释板。将一排P-20吸头安装到96通道移液器上。

从样品板中吸取 11.1 微升匀浆液，加入到每孔含有 100 微升无菌 PBS 的第一稀释板中，制成 1:10 的稀释液。将稀释板置于板式振荡器上，以 600 转/分钟振荡 10 秒。

用移液器上下吹打至少10次，再次混匀。从第一块稀释板中转移11.1 µL至第二块稀释板，并对后续所有稀释步骤重复混匀操作。对于点样板，从每个孔中吸取2 µL加入96通道移液器中。

将移液器枪头缓慢放入平板中，避免刺入琼脂，确保所有点样均已分配完毕。然后检查液体斑点是否迅速渗入琼脂，且未发生扩散融合。按照文中的描述，对剩余的稀释平板重复涂布过程。

待液体完全被琼脂吸收后，将平板倒置，并孵育至菌落达到最佳大小。拍照时需合理组织平板，并按特定顺序摆放，确保所有平板的 A1 位置均位于左上角。

移去培养皿盖后，将培养皿放置在载物台上，确保A1孔位于正确的角落。对培养皿进行成像。将图像转移至计算机，并重命名文件，文件名应包含实验名称、培养基类型、稀释倍数及其他相关细节。

将需要进行定量分析的图像整理到一个文件夹中。用于区分不同培养板的文件名将成为输出电子表格中每组计数结果的列标题。在该文件夹中创建名为 Cropped 和 Receipts 的子文件夹。

这些文件夹将用于存放输出文件。现在从 ImageJ 中启动 Croptacular 插件，然后单击“确定”以开始裁剪。此时将弹出一个对话框，用于选择源文件夹。

单击“确定”。选择源文件夹，然后单击“打开”。接着，在选择目标目录的对话框中单击“确定”。选择目标文件夹，然后按“打开”。

如果图像已平直，直接按空格键即可。否则，请沿应变为水平的一条边缘绘制一条线以校正图像。若图像仍未平直，可重复绘制线条直至图像对齐。

接下来，为计数区域绘制一个边界框，并调整其大小和比例，直到所有斑点均位于各自的细胞内。将光标拖动到边界框外以刷新网格。当网格显示合适后，按下空格键。

由于插件假定所有照片的对齐方式完全相同，请确保下一张图像自动旋转至与第一张相同的角度。如果角度正确，请按空格键继续；否则，请像之前一样校正图像。

网格还会显示上一张图像中的相同位置。如有必要，进行调整，然后按空格键。启动 Count-On-It 并选择 Gridiron。

根据像素强度的上限值和下限值设定菌落强度阈值。在确保选中所有菌落的前提下，尽可能严格地设置阈值。当阈值满意后，点击“操作提示”对话框中的“确定”，然后点击“确定”继续。

在第一张图像中，可选择继续执行或返回设置菜单。若要继续批量处理，请点击“确定”。然后，选择一个文件夹以保存收据和结果表格。使用之前创建的“收据”文件夹。

第一幅图像之后，后续图像将默认采用与之前设置相同的阈值。单击“确定”以使用这些设置，或调整设置。