表面金属转运蛋白的检测 淋病奈瑟菌 使用点印迹法

从在金属耗竭培养基中培养的 Neisseria gonorrhoeae 菌种开始。

金属缺乏会触发外膜转运蛋白的表达，以便在有金属可用时启动其摄取。

将预先浸泡过的硝酸纤维素膜置于湿润的滤纸上，并组装点印迹装置。

点样细菌细胞，并让液体充分吸收。

拆卸装置，取出膜，并使其在空气中干燥。

加入阻断剂以防止非特异性结合。

将膜重新插入装置中，用封口膜密封，并重新组装。

加入宿主来源的金属结合配体，振荡孵育。

配体结合到细菌转运蛋白上。

移去液体，并洗涤膜以去除未结合的配体。

加入针对配体的特异性一抗，随后加入酶标记的二抗和显色检测试剂，生成有色产物。

可见信号表明在金属受限条件下细菌金属转运蛋白的表达。

在完成倍增培养后，用三倍体积的化学成分明确培养基（CDM）对菌液进行回稀。随后，将菌液在37摄氏度下振荡培养四小时。在接近四小时时间点前，裁剪三片滤纸和一片硝酸纤维素膜，使其大小大致适合放入点印迹装置中。

在组装装置前，将硝酸纤维素膜在去离子水中预浸泡约10分钟，装置中硝酸纤维素膜下方需放置滤纸。孵育结束后，记录细胞密度，并将密度调整至适当的终浓度。然后，用移液器将细胞培养物加到硝酸纤维素膜上。

当滤纸完全吸收液体后，拆卸装置并让印迹自然干燥。用适当的封闭液封闭硝酸纤维素膜一小时，然后重新组装点印迹装置，将滤纸替换为石蜡膜，以在硝酸纤维素膜下形成防漏密封。将感兴趣的金属结合配体用封闭液稀释至0.2微摩尔，在温和振荡条件下孵育细胞一小时。

孵育结束后，用真空泵吸去液体，洗涤印迹膜，然后按照标准免疫学程序显色。