为什么在大肠杆菌（E. coli）中进行靶点验证时转化效率很重要？

高转化效率可确保获得足够数量的工程化细胞，以实现可靠的蛋白表达，这对于在早期发现阶段准确评估靶标功能及其参与的信号通路至关重要。

在电穿孔过程中对变量进行隔离如何支持发现流程的一致性？

控制电压、脉冲长度和细胞制备等参数可最大限度地减少DNA摄取的变异性，从而在不同实验和团队之间实现可重复的菌株构建。

哪些定量测量方法可用于评估微生物系统中电穿孔的效果？

在含抗生素的选择性平板上进行菌落形成单位计数，可直接衡量转化效率，使研究团队能够比较不同条件并优化实验方案。

为什么复制要求对于微生物工程中的跨职能协作至关重要？

重复实验可确保转化结果在不同实验室之间具有一致性和可转移性，从而支持从菌株构建到表达和筛选团队的可靠交接。

在将电穿孔技术应用于发现工作流程之前，需要具备哪些统计分析能力？

团队必须能够量化转化效率，评估重复样本间的变异，并应用成功阈值，以确保菌株构建流程中方法的可靠性。

使用高压电穿孔法进行细菌的制备与转化

JoVE Encyclopedia of Experiments

微生物学

0 次观看 • 3:33 分钟 • October 30th, 2025

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从一支含有接种于营养培养基中的细菌的试管开始。

振荡培养直至细胞进入活跃分裂期。

离心以收集细胞，并弃去上清液。

用预冷的甘油反复洗涤细胞以去除盐分，并将细胞重悬于甘油中以维持细胞活力。

将含有抗生素抗性基因的质粒用含EDTA的无菌水配制，以防止DNA降解。

将质粒溶液与细菌细胞混合。

施加短暂的高电压脉冲，以在细菌膜上暂时形成孔隙。

这使得质粒 DNA 能够进入细胞质。

立即将细胞转移至恢复培养基中，并在振荡条件下孵育。

培养基的成分支持膜修复和质粒编码的抗生素抗性基因表达。

将细胞涂布于含有抗生素的营养琼脂平板上，培养至菌落形成。

挑取单个菌落，并将其划线接种到新鲜培养基平板上，以纯化转化子。

实验开始时，制备 Top 10 E. coli 菌株的感受态细胞。

将单个菌落转移至1 mL LB培养基中。在37°C、180 RPM振荡条件下培养试管。将预培养物按1:500比例稀释至25 mL新鲜LB培养基中，并在37°C培养至对数生长期OD600达到0.6。以5,000 RPM离心细胞悬液20分钟。

离心后，将沉淀重悬于25毫升10%体积比的冰上预冷无菌甘油水溶液中，重复此步骤四次，每次重悬体积逐渐减少，直至最终体积达到1.5毫升。

接下来，将沉淀重悬于10%甘油中，并将细胞悬液分装为每份50 µL。将分装样品在-80 °C条件下保存，可保存长达六个月。为继续实验，将所需质粒溶解于含有0.5 mmol/L EDTA的无菌水中，并在冰上融化一份电转感受态细胞 aliquot。

加入2.5至5纳克的载体并混匀解冻的细胞。将细胞分装至0.1厘米的电击杯中。对细胞施加1.8千伏的电脉冲，并立即将电穿孔后的细胞转移至1毫升SOC培养基中。

将细胞振荡培养一小时，取100微升等份试样转移至含有LB琼脂和抗生素的培养皿中，于37摄氏度过夜培养。通过在培养皿上划线单菌落，纯化转化子。