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微生物学
0 次观看 • 3:33 分钟 • October 30th, 2025
从一支含有接种于营养培养基中的细菌的试管开始。
振荡培养直至细胞进入活跃分裂期。
离心以收集细胞，并弃去上清液。
用预冷的甘油反复洗涤细胞以去除盐分，并将细胞重悬于甘油中以维持细胞活力。
将含有抗生素抗性基因的质粒用含EDTA的无菌水配制，以防止DNA降解。
将质粒溶液与细菌细胞混合。
施加短暂的高电压脉冲，以在细菌膜上暂时形成孔隙。
这使得质粒 DNA 能够进入细胞质。
立即将细胞转移至恢复培养基中，并在振荡条件下孵育。
培养基的成分支持膜修复和质粒编码的抗生素抗性基因表达。
将细胞涂布于含有抗生素的营养琼脂平板上，培养至菌落形成。
挑取单个菌落，并将其划线接种到新鲜培养基平板上，以纯化转化子。
实验开始时，制备 Top 10 E. coli 菌株的感受态细胞。
将单个菌落转移至1 mL LB培养基中。在37°C、180 RPM振荡条件下培养试管。将预培养物按1:500比例稀释至25 mL新鲜LB培养基中，并在37°C培养至对数生长期OD600达到0.6。以5,000 RPM离心细胞悬液20分钟。
离心后，将沉淀重悬于25毫升10%体积比的冰上预冷无菌甘油水溶液中，重复此步骤四次，每次重悬体积逐渐减少，直至最终体积达到1.5毫升。
接下来，将沉淀重悬于10%甘油中，并将细胞悬液分装为每份50 µL。将分装样品在-80 °C条件下保存，可保存长达六个月。为继续实验，将所需质粒溶解于含有0.5 mmol/L EDTA的无菌水中，并在冰上融化一份电转感受态细胞 aliquot。
加入2.5至5纳克的载体并混匀解冻的细胞。将细胞分装至0.1厘米的电击杯中。对细胞施加1.8千伏的电脉冲，并立即将电穿孔后的细胞转移至1毫升SOC培养基中。
将细胞振荡培养一小时，取100微升等份试样转移至含有LB琼脂和抗生素的培养皿中，于37摄氏度过夜培养。通过在培养皿上划线单菌落，纯化转化子。